华南师范大学：《植物生理学》课程教学资源（实验指导）实验9 硝酸还原酶活性的测定

实验9硝酸还原酶活性的测定一、目的学会植物组织中硝酸还原酶活性的测定方法。二、材料用具及仪器药品木茨叶或菠菜叶子、葩麻叶、721型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、三角瓶、移液管、烧杯、洗耳球0.1mo1/L磷酸缓冲液（pH7.5）、0.2mol/LKNOs）；磺胺试剂、a-苯胺试剂，NaNO2标准溶液：a一萘胺试剂配制：0.2克a一萘胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。磺胺试剂配制：取1克磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml，NaNO,标准溶液：1克NaNO,用蒸馅水溶解，定量至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水定量至1000ml，该溶液每ml含有NaNO25ug，用时稀释之。磷酸缓冲液：贮备液A：0.2mol/LNaHzPO.溶液（27.8gNaH,PO,·H20配成1000ml）。贴备液B：0.2mo1/LNa,HPO,溶液（53.65gNa,HPO,·7H0或NaHPO·12H0配成1000ml）取A液16ml+B液84ml，用水稀释至200ml三、原理硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有关，它作用于NO还原于NO2NO +NADIFNO2+NAD*+H,O产生的NO可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO2的含量的高低，即表明酶活性的大小。NO，含量的测定用磺胺（对氨基苯磺酸胺sulfanil一amide）比色法，这种方法非常灵敏，能测定每m10.5ug的NaNO2。四、方法步骤1.将新鲜叶片（葩麻、烟草、木茨叶等）水洗，用吸水纸吸干水分，然后用1cm的钻孔器钻取的圆片，在天平上称取等量的叶圆片两份，每份0.5克，（或每份取50个叶圆片），分别置于含有下列溶液的三角瓶中，（1）0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml。（2）0.1mo1/L磷酸缓冲溶液5ml+0.2mo1/LKNO，5ml。然后将三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，叶圆片即沉于溶液中，（如果没有真空瓶，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器内，，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使之真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使叶圆片中的空气抽去，并沉于溶液中），将三角瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸取反应溶液1ml，以测定N02含量。注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可在反应溶液中加入30μmo1的3一磷酸甘油醛或1.6一一二磷酸果糖，能显著增加NO，的产生。2.NO2含量的测定保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，先加入磺胺试剂2ml，后加入一

实验 9 硝酸还原酶活性的测定 一、目的 学会植物组织中硝酸还原酶活性的测定方法。 二、材料用具及仪器药品 木茨叶或菠菜叶子、蓖麻叶、721 型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、 真空干燥器、钻孔器、三角瓶、移液管、烧杯、洗耳球 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.5）、0.2mol/L KNO3）；磺胺试剂、a-苯胺试剂，NaNO2 标准溶液： a—萘胺试剂配制：0.2 克 a—萘胺加 25ml 浓盐酸，用蒸馏水稀释至 100ml。 磺胺试剂配制：取 1 克磺胺加 25ml 浓盐酸，用蒸馏水稀释至 100ml. NaNO2 标准溶液：1 克 NaNO2 用蒸馏水溶解，定量至 1000ml，然后吸取 5ml，再加蒸馏水 定量至 1000ml，该溶液每 ml 含有 NaNO25ug，用时稀释之。 磷酸缓冲液： 贮备液 A：0.2mol/L NaH2PO4 溶液（27.8g NaH2PO4·H2O 配成 1000ml）。 贮备液 B：0.2 mol/L Na2HPO4 溶液（53.65g Na2HPO4·7H2O 或 Na2HPO4·12H2O 配成 1000ml） 取 A 液 16ml+B 液 84ml，用水稀释至 200ml 三、原理 硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有关，它作用于 NO— 3 还原于 NO— 2 NO— 3+NADH+ NO— 2+NAD+ +H2O 产生的 NO- 2 可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中 NO- 2 的含量 的高低，即表明酶活性的大小。 NO- 2 含量的测定用磺胺（对氨基苯磺酸胺 sulfanil—amide）比色法，这种方法非常灵 敏，能测定每 m10.5ug 的 NaNO2。 四、方法步骤 1．将新鲜叶片（蓖麻、烟草、木茨叶等）水洗，用吸水纸吸干水分，然后用 1cm 的钻 孔器钻取的圆片，在天平上称取等量的叶圆片两份，每份 0.5 克，（或每份取 50 个叶圆片）， 分别置于含有下列溶液的三角瓶中，（1）0.1mol/L 磷酸缓冲溶液 5ml+蒸馏水 5ml。（2） 0.1mol/L 磷酸缓冲溶液 5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角瓶置于真空干燥器中，接上真 空泵抽气，放气后，叶圆片即沉于溶液中，（如果没有真空瓶，也可以用 20ml 注射器代替， 将反应液及叶片一起倒入注射器内,，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使之 真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使叶圆片中的空气抽去，并沉于溶液中），将三角 瓶置于 30℃温箱中，使不见光，保温作用 30 分钟，然后分别吸取反应溶液 1ml，以测定 NO- 2 含量。 注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化 合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可在反应溶液中加入 30μmol/L 的 3—磷酸甘 油醛或 1.6——二磷酸果糖，能显著增加 NO- 2 的产生。 2．NO- 2 含量的测定 保温 30 分钟结束时，吸取反应溶液 1ml 于一试管中，先加入磺胺试剂 2ml，后加入一

萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用分光光计进行比色测定，比色时用520nm波长，记下光密度，从标准曲线上查得NO2含量，然后计算酶活性，以每小时每克鲜重产生的NO表示之。3.绘制标准曲线测定NOz的磺胺比色法很灵敏，可以检出低于lug/ml的NaNO2含量，可于0～5ug/ml浓度范围内绘制标准曲线。吸取不同浓度的溶液（例如5、4、3、2、1、0.5ug/ml）1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及一萘胺试剂2ml。混合摇匀，静置30分钟（或于一定温度的水浴中保温30分钟）立即于分光光色计下进行比色，（波长520nm），读取光密度，然后，以光密度为纵坐标，N02浓度为横坐标，于毫米方格纸上绘制光密度一一浓度曲线。五、实验报告计算所测材料硝酸还原酶的活性。六、思考题1、试比较不同植物的硝酸还原酶活性2、试比较取样前植物处于光照或黑暗条件下酶活性有什么不同

萘胺试剂 2ml，混合摇匀，静置 30 分钟，用分光光计进行比色测定，比色时用 520nm 波长， 记下光密度，从标准曲线上查得 NO- 2 含量，然后计算酶活性，以每小时每克鲜重产生的 NO- 2 表示之。 3．绘制标准曲线 测定 NO- 2 的磺胺比色法很灵敏，可以检出低于 1ug/ml 的 NaNO2 含量，可于 0～5ug/ml 浓度范围内绘制标准曲线。 吸取不同浓度的溶液（例如 5、4、3、2、1、0.5ug/ml）1ml 于试管中，加入磺胺试剂 2ml 及一萘胺试剂 2ml。混合摇匀，静置 30 分钟（或于一定温度的水浴中保温 30 分钟）立 即于分光光色计下进行比色，（波长 520nm），读取光密度，然后，以光密度为纵坐标，NO- 2 浓度为横坐标，于毫米方格纸上绘制光密度——浓度曲线。 五、实验报告 计算所测材料硝酸还原酶的活性。 六、思考题 1、试比较不同植物的硝酸还原酶活性。 2、试比较取样前植物处于光照或黑暗条件下酶活性有什么不同

附表：xmlA+ymlB.稀释至200mlPHXYYpHx5.76. 993. 56. 5 45. 055.05.892.08. 07. 039.061.05.990.010. 07. 133.067. 06.087.712.37.228.072.06. 185.015.07. 323.077. 06.27. 481. 518.519.081.06.377. 522.57.516.084.07. 687.06.473. 526.513.06.568. 531.57.710.589.56.67. 88.591.562. 537.57. 06.756.543.57.993.05.36.851.08.094.749.0

附表： xmlA+ymlB.稀释至 200ml PH x Y pH x Y 5.7 5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 93.5 92.0 90.0 87.7 85.0 81.5 77.5 73.5 68.5 62.5 56.5 51.0 6.5 8.0 10.0 12.3 15.0 18.5 22.5 26.5 31.5 37.5 43.5 49.0 6.9 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 45.0 39.0 33.0 28.0 23.0 19.0 16.0 13.0 10.5 8.5 7.0 5.3 55.0 61.0 67.0 72.0 77.0 81.0 84.0 87.0 89.5 91.5 93.0 94.7