华南师范大学：《植物生理学》课程教学资源（实验指导）实验16 蛋白质含量测定

实验16蛋白质含量测定一、Folin—酚法（一）目的了解用Folin一酚法测定蛋白质的含量。（二）材料用具及仪器药品植物721型分光光度计、吸管、试管、试管架、容量瓶、移液管标准酪蛋白质溶液：称取结晶酪蛋白100mg，用少量0.5mo1/LNa0H溶液湿润溶解，加蒸馏水定容至100ml，则配成1mg/ml的标准酪蛋白溶液。Folin一酚试剂的配制：试剂A：1gNazCO溶于50ml的0.1mo1/LNaOH溶液，另将0.5gCuS0,·5H20溶于100ml的1%酒石酸钾（或酒石酸钠）溶液，实验时按前者：后者=50：1的比例混合，此混合液最多只能用一天。试剂B：将100g钨酸钠（NazWO,·2H,0），25g钼酸钠（NazM.0,·2H20)、700ml蒸馏水、再加50ml85%磷酸及100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50m1及液体漠数滴，开口煮沸15分钟，驱除过量的漠（在通风橱内进行），冷却，用蒸馏水稀释至1000ml，过滤，滤液呈现微绿色，贮于棕色瓶中，临用前，用酚酞作指示剂，用标准NaOH溶液滴定，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L酸度，备用。（三）原理Folin一酚法所用的试剂是由两部分组成的，试剂A相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应，试剂B（磷钨酸和磷钼酸混合液）在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝混合物）。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比。（四）方法步骤1.绘制标准曲线用标准酪蛋白溶液配制成浓度分别为：0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mg/ml的系列标准溶液各10ml，将试管编号，依次向各管中加入上述蛋白质溶液0.5ml和Fo1in一酚试剂A4ml，摇匀，室温放置10分钟后，再加入Folin一酚试剂B0.5ml，30分钟后在分光光度计650nm波长下比色，测定OD值，以蛋白质含量为横坐标，光刻度值为纵坐标作光刻度一蛋白质浓度曲线。2.样品测定：准确吸取样液0.5ml于试管内，加试剂A、B及比色等操作步骤同标准曲线操作，测出其OD值。计算用下式进行计算：蛋白质含量（mg/ml）=DXN/V式中：D为标准曲线上查出的蛋白质含量（mg/ml）N为稀释倍数V为蛋白质溶液的体积（ml）

实验 16 蛋白质含量测定 一、Folin—酚法 （一）目的 了解用 Folin—酚法测定蛋白质的含量。 （二）材料用具及仪器药品 植物 721 型分光光度计、吸管、试管、试管架、容量瓶、移液管 标准酪蛋白质溶液： 称取结晶酪蛋白 100mg，用少量 0.5mol/L NaOH 溶液湿润溶解，加蒸馏水定容至 100ml， 则配成 1mg/ml 的标准酪蛋白溶液。 Folin—酚试剂的配制： 试剂 A：1gNa2CO3 溶于 50ml 的 0.1 mol/L NaOH 溶液，另将 0.5g CuSO4· 5H2O 溶于 100ml 的 1%酒石酸钾（或酒石酸钠）溶液，实验时按前者：后者=50：1 的比例混合，此混合液最 多只能用一天。 试剂 B：将 100g 钨酸钠（Na2WO4·2H2O），25g 钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、700ml 蒸馏水、再加 50ml 85%磷酸及 100ml 浓盐酸置于 1500ml 的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝 管，回馏 10 小时，再加入硫酸锂 150g，蒸馏水 50ml 及液体溴数滴，开口煮沸 15 分钟，驱 除过量的溴（在通风橱内进行），冷却，用蒸馏水稀释至 1000ml，过滤，滤液呈现微绿色， 贮于棕色瓶中，临用前，用酚酞作指示剂，用标准 NaOH 溶液滴定，根据滴定结果，将试剂 稀释至相当于 1mol/L 酸度，备用。 （三）原理 Folin—酚法所用的试剂是由两部分组成的，试剂 A 相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中 的肽键起显色反应，试剂 B（磷钨酸和磷钼酸混合液）在碱性条件下极不稳定，易被酚类化 合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝混合物）。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正 比。 （四）方法步骤 1．绘制标准曲线 用标准酪蛋白溶液配制成浓度分别为：0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mg/ml 的系 列标准溶液各 10ml,将试管编号，依次向各管中加入上述蛋白质溶液 0.5ml 和 Folin—酚试 剂 A 4ml，摇匀，室温放置 10 分钟后，再加入 Folin—酚试剂 B 0.5ml, 30 分钟后在分光 光度计 650nm 波长下比色，测定 OD 值，以蛋白质含量为横坐标，光刻度值为纵坐标作光刻 度一蛋白质浓度曲线。 2．样品测定：准确吸取样液 0.5ml 于试管内，加试剂 A、B 及比色等操作步骤同标准 曲线操作，测出其 OD 值。 计算 用下式进行计算： 蛋白质含量（mg/ml）=D×N/V 式中：D 为标准曲线上查出的蛋白质含量（mg/ml） N 为稀释倍数 V 为蛋白质溶液的体积（ml）

（五）实验报告计算所测材料的蛋白质含量。（六）思考题试说明Folin一酚法测定蛋白质含量有什么优缺点

（五）实验报告 计算所测材料的蛋白质含量。 （六）思考题 试说明 Folin—酚法测定蛋白质含量有什么优缺点