复旦大学：《分子生物学理论与实验》教学课件_蛋白质分析技术（二）

蛋白质分析技术2 复旦大学基础医学院 潘銮风

蛋白质分析技术2 2 复旦大学基础医学院 潘銮凤

免疫荧光技术 利用某些荧光素,如FITC、PE等通过化学 反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针, 然后与被测抗原或配体发生特异性结合,形成 的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧 光。因此利用普通荧光显微镜、共聚焦荧光显 微镜或流式细胞仪可检测细胞表面、内部抗原 或相应配体等

免疫荧光技术 利用某些荧光素，如FITC、PE等通过化学 反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针， 然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成 的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧 光。因此利用普通荧光显微镜、共聚焦荧光显 微镜或流式细胞仪可检测细胞表面、内部抗原 或相应配体等

流式细胞术 概念 流式细胞术( Flow Cytometry,FCM) 利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状忞中的 单细胞或生物颗粒(包括细胞核和染色体)进行多参 数、快速定量分析,同时对特定群体加以分选的现 代细胞分析技术。 流式细胞仪( Flow Cytometer) 杗激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子 计算机技术、细胞光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的一种新型高科技仪器

一、流式细胞术  流式细胞术（Flow Cytometry，FCM） 利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的 单细胞或生物颗粒(包括细胞核和染色体）进行多参 数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现 代细胞分析技术。  流式细胞仪（Flow Cytometer) 集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子 计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的一种新型高科技仪器。 概念

流式细胞仪特点 单细胞是瀛 可生物粒 当能先的细鹃 多参 度高

5 流式细胞仪特点 单细胞悬液 或生物颗粒 分析速度高 多参数 精度高 当代先进的细胞定 量分析技术

流式细胞仪的工作原理 °光学系统 激光光源 GREEN 光收梟系统 GREEN 液流系统 ASER 流动 imput RED 液流驱动系統 电子系统 FSC 光电转换 ∧ SSC 教据处理系統 细胞分选系鴕 光信号电信号数字信号

流式细胞仪的工作原理 • 光学系统 激光光源 光收集系统 • 液流系统 流动室 液流驱动系统 • 电子系统 光电转换 数据处理系统 • 细胞分选系统 光信号 电信号 数字信号

液流系统:流动室、液流驱动系統 对细胞群 体的各个 细胞分别 荧光信号 鞘液进行检测 激光束 图1-2 勺流动室和液流驱动系统

液流系统：流动室、液流驱动系统 对细胞群 体的各个 细胞分别 进行检测

Fluorescence Activated Cell Sorting 细胞悬液形成液流柱 压电晶体产生机械振动 488 nm lase 流动室振动 FALS Sensor Fluorescence detector 液流断裂成液滴 + Charged Plates 空白液滴 含细胞的液滴 不充电 充电 Single cells sorted 弃去 偏转落入收集器 into test tubes

Fluorescence Activated Cell Sorting 488 nm laser - + Charged Plates Single cells sorted into test tubes FALS Sensor Fluorescence detector 细胞悬液形成液流柱 流动室振动 液流断裂成液滴 空白液滴 含细胞的液滴 弃去 偏转落入收集器 压电晶体 产生机械振动 不充电 充电

信号检测散色光 它反应细胞的物理特性根据前/侧向散射光 可以把不同类型的细胞群加以区分 FSC(小角散射)光 它反应细胞的相对大申性画 小和截面积的大小 SsC(90度角散射光) 单弦细胞 代表细胞的颗粒度和 ]淋巴细胞 崭细袍的变化 FSC-H 全血细胞流式FSC-SSC图

信号检测--散色光 FSC（小角散射)光 它反应细胞的相对大 小和截面积的大小 SSC (90度角散射光) 代表细胞的颗粒度和 精细结构的变化 全血细胞流式FSC-SSC图 它反应细胞的物理特性,根据前/侧向散射光， 可以把不同类型的细胞群加以区分

信号检测-荧光信号(FL) 激发态 这能量损失 发射 能量级 激光 (FITCA 特异熒光 一舭仪器可区分8~9个荧光 >最多检测15个荧光参数 自发荧光

信号检测--荧光信号（FL) 自发荧光 特异荧光 能量级 激发 激发态 发射 激光 能量损失 一般仪器可区分8~9个荧光 最多检测15个荧光参数

教据显示类 CTN.O0 NORMD02 X轴:代表荧光信号或 散射光信号的强度。用 “通道数”表示。可以 与光强度之间线性关系 88 对数关系 Y轴:代表该通道内所 020040060080100 出现具有相同光信号特 FL2-Aree CD3 LewA 征性细胞的频率(细胞 相对数量) 单参数直方图( Histogram)

数据显示类型 单参数直方图（Histogram） X轴：代表荧光信号或 散射光信号的强度，用 “通道数”表示，可以 与光强度之间线性关系 或对数关系 Y轴：代表该通道内所 出现具有相同光信号特 征性细胞的频率（细胞 相对数量）