复旦大学：《分子生物学理论与实验》教学课件_实验四 RealTime PCR

细胞中 c-myc mRNA表达水平的检测与分析 王松梅 复旦大学基础医学院医学实验教学中心 东5号楼405室 smwang2@fudan.edu.cn

细胞中c-myc mRNA表达水平的检测与分析 王松梅 复旦大学基础医学院医学实验教学中心 东5号楼405室 smwang2@fudan.edu.cn

基因的mRNA表达分析流程 样本采集 RNA RealTime 数据 稳定破碎 纯化 RT PCR 分析 本次实验课观察cmy小分子抑制剂10058F4对HL60细胞中cmyc 基因mRNA表达水平的影响

样本采集 稳定破碎 RNA 纯化 RealTime RT PCR 数据 分析 基因的mRNA表达分析流程 本次实验课观察c-myc小分子抑制剂10058-F4对HL60细胞中c-myc 基因mRNA表达水平的影响

学习目标 能对细胞中特定基因的mRNA 的表达水平进行检测和分析 括 能够用 Triz试剂抽提细胞总RNA 以所抽提的细胞总RNA为模板合成CDNA第一链 掌握Rea|- Time PCr原理和操作技术 对Rea- Time PCr所得到的数据进行处理和分析

学习目标 能够用Trizol试剂抽提细胞总RNA 以所抽提的细胞总RNA为模板合成cDNA第一链 掌握Real-Time PCR 原理和操作技术 对Real-Time PCR所得到的数据进行处理和分析 包 括

实验原理(-) Triz法抽提细胞 总RNA

TRiz抽提RNA的方法:(异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法) TRzo!是 Life Technologies公司的商品名 Dr. Piotr Chomczynski Dr N aletta sacchi ife Single-step method of rna isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. 1987

TRizol抽提RNA的方法：（异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法 ） TRIzol是Life Technologies公司的商品名 Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. 1987

TRIzol作用原理 Trizol能迅速裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释放。在 匀质化或溶解样品中,TRzo试剂可保持RNA的完整性,同时能破坏细 胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后,裂解液分离成水相和有机相 RNA存在于水相。通过异丙醇沉淀,将水相中的RNA回收。 令主要成分是酚,可有效的变性蛋白质,但是酚不能完全抑制RNA酶活性。 ◆0.1%的8-羟基喹啉,与氯仿联合使用可增强对 RNasel的抑制 ◆异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质,并 使蛋白质二级结枃消失,细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离。 ◆β-巯基乙醇主要破坏 RNase蛋白质中的〓硫键

TRIzol作用原理 Trizol 能迅速裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。在 匀质化或溶解样品中，TRIzol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细 胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分离成水相和有机相。 RNA存在于水相。通过异丙醇沉淀，将水相中的RNA回收。  主要成分是酚，可有效的变性蛋白质，但是酚不能完全抑制RNA酶活性。  0.1%的8-羟基喹啉，与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制  异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并 使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。  β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键

实验原理(二) cDNA第一链的合成

Thermo scientific RevertAid第一链 CDNA Synthesis试剂盒 RevertAidTM M-MuLV反转录酶(200u/μ) 5×反应缓冲液 250 mM Tris-HCl(pH 8.3), 250 mM KCl, 20 mM MgCl2, 50 mM DTT) oligo(dT18引物100μM,0.5ug/p(15A260u/m) 无核酸酶高纯度水( RNase free water) Ribolock rnase inhibitor

Thermo Scientific RevertAid™第一链cDNA Synthesis试剂盒 • RevertAid™ M-MuLV反转录酶（200 u/μl） • 5×反应缓冲液 （250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 250 mM KCl, 20 mM MgCl2, 50 mM DTT） • Oligo(dT)18 引物 100 μM, 0.5 μg/μl (15 A260 u/ml) • 无核酸酶高纯度水（RNase free water） • Ribolock RNase Inhibitor

Total RNA Mature-miRNA PolyA polymeras Poly (A)add AAAAAAAAAA A oligodT-adaptor and then RT reaction RT Reaction AA TTTTTTTTT 5 CDNA productor CDNA template ready for qPCR miRNA q- PCR Primer qPCR test Universal Adaptor PCR Primer

实验原 Real-Time PCR