复旦大学：《分子生物学理论与实验》教学课件_蛋白质分析技术（一）

蛋白质分析技术

蛋白质分析技术 潘銮凤

浓度;纯度;分子量;等电点;活性;序列;结构;分离纯 蛋白质浓度的测定 ∴.聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 三.免疫印迹( Western blot) 四.酶联免疫吸附反应(EL|SA 五.蛋白质组学实验方法 六.生物膜光干涉技术(BL 七.蛋白质相互作用其他研究技术

2 一. 蛋白质浓度的测定 二. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 三. 免疫印迹（Western blot） 四. 酶联免疫吸附反应（ELISA) 五. 蛋白质组学实验方法 六. 生物膜光干涉技术（BLI） 七. 蛋白质相互作用其他研究技术 浓度; 纯度; 分子量; 等电点; 活性; 序列; 结构;分离纯化

蛋白质浓度的测定 1. Lowry法( Folin-酚试剂法) 双缩脲反应产物中酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸-磷钨 酸( Folin试剂)产生深蓝色;A50080;,25-250μg/mL 2B0A法( bicinchon inin acid,二辛可宁酸) 碱性条件下,蛋白质将0u还原为0u+,一个0u螯合 二个BGA分子,形成紫色复合物,最大光吸收强度与蛋白质浓 度成正比。微量BA测定范围在0.5-10μg/m,抗干扰能力强

3 一 . 蛋白质浓度的测定 1. Lowry法(Folin-酚试剂法) 双缩脲反应产物中酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸-磷钨 酸(Folin试剂) 产生深蓝色； A500-800; 25-250 mg/mL 2.BCA法（bicinchonininc acid，二辛可宁酸） 碱性条件下，蛋白质将Cu2+ 还原为Cu+ ，一个Cu+ 螯合 二个BCA分子，形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓 度成正比。微量BCA测定范围在0.5-10μg/ml，抗干扰能力强

3.考马斯亮蓝G-250染色法( Bradford法) 考马斯亮蓝G-250所含疏水基团与蛋白质通过疏 水作用结合产生蓝色;受去污剂干扰 595: 10 ug/mL-10 mg/ML 上述三种方法均需制作标准曲线(吸光度值随浓度的变 化曲线),样品浓度应稀释在标准曲线范围内; 标准蛋白:BSA、酪蛋白等

4 3. 考马斯亮蓝G-250染色法（Bradford法） 考马斯亮蓝G-250所含疏水基团与蛋白质通过疏 水作用结合产生蓝色; 受去污剂干扰 A595; 10 mg/mL -10 mg/mL 上述三种方法均需制作标准曲线（吸光度值随浓度的变 化曲线），样品浓度应稀释在标准曲线范围内; 标准蛋白：BSA、酪蛋白等

4.紫外吸收法 酪氨酸和色氨酸中苯环共轭双键的紫外吸收特性, 吸收峰在280nm 0. 2-2 mg/mL 标准曲线可有可无,若无 蛋白浓度(mg/m)=1.45A280-0.74A260 迅速简便,不消耗样品 核酸会产生干扰

5 4. 紫外吸收法 酪氨酸和色氨酸中苯环共轭双键的紫外吸收特性， 吸收峰在280 nm • 0.2-2 mg/mL • 标准曲线可有可无，若无 蛋白浓度（mg/mL)＝1.45A280－0.74A260 • 迅速简便，不消耗样品 • 核酸会产生干扰

二。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 1.聚丙烯酰胺凝胶潘化剂丙烯酰胺(Acr) 亚甲基双丙烯酰胺(Bis) 2.装置垂直板状 SDs处理的样品 圆盘状 Ss東内烯酰胶凝饺 夹在两玻璃片之间 水平板

6 二．聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） ( polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE） 丙烯酰胺（Acr） 催化剂 1. 聚丙烯酰胺凝胶 亚甲基双丙烯酰胺（Bis） 2. 装置 垂直板状 圆盘状 水平板

3.连续系统: 分离胶:电荷效应、分子筛效应 不连续系统: 浓缩胶:使样品浓缩成窄区带 分离胶:分离蛋白质 电荷效应、分子筛效应、浓缩效应

7 3. 连续系统： 分离胶：电荷效应、分子筛效应 不连续系统： 浓缩胶：使样品浓缩成窄区带 分离胶：分离蛋白质 电荷效应、分子筛效应、浓缩效应

4.PAGE电泳分类 SDS-PAGE 分子量不同 梯度凝胶电泳( PG-PAGE) 等电聚焦电泳( IEF-PAGE)←等电点不同 单向(1-D) 双向(2-D)

8 4. PAGE电泳分类 SDS-PAGE 梯度凝胶电泳(PG-PAGE) 分子量不同 等电聚焦电泳（IEF-PAGE） 等电点不同 单向（1-D） 双向（2-D）

蛋白质凝胶染色 染料名称 特点 氨基黑 一般染色,也适合于膜染色 考马斯亮蓝 一般染色,简单、快速、牢固。 改良后达到15ng/band 银染 高度灵敏,2~10ng/band 荧光染 多种染料、快速、高度灵敏,可自动化 0.5-10 ng/band,IEF凝胶的理想选择 同位素标记 高度灵敏,可自动化、常用于预标记蛋白 辐射污染

9 蛋白质凝胶染色 染料名称 特点 氨基黑 一般染色，也适合于膜染色 考马斯亮蓝 一般染色，简单、快速、牢固。 改良后达到15 ng/band 银染 高度灵敏，2~10 ng/band 荧光染 多种染料、快速、高度灵敏，可自动化 0.5-10 ng/band，IEF 凝胶的理想选择 同位素标记 高度灵敏，可自动化、常用于预标记蛋白 辐射污染

SDS-PAGE电泳结果 考马斯亮蓝染色 银染色

10 考马斯亮蓝染色 银染色 SDS-PAGE电泳结果