复旦大学：《分子生物学理论与实验》教学课件_实验四 Real time qPCR

实验四 Real time qPCR

实验四 Real time qPCR

实验目的

实验目的 1

一实验目的 掌握Real- time gPCR原理和操作技术 对Rea1- time qPCR所得到的数据进行处理和分析

一.实验目的 掌握Real-time qPCR 原理和操作技术 对Real-time qPCR所得到的数据进行处理和分析

实验原理

实验原理 2

PCR 多聚酶链反应(PCR)技术的原理类似于DNA天然复制 过程,可简述为: 微量离心管中加入缓冲液、模板DNA、dⅦTP、耐热 Ta聚合酶及一对引物。经以下三个步骤反复进行: I.高温变性:9-96℃ I.退火: 50-65℃ Il延伸 72℃(普通taq)

PCR 多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA天然复制 过程,可简述为： 微量离心管中加入缓冲液、模板DNA 、dNTP、耐热 Taq聚合酶及一对引物。经以下三个步骤反复进行： I. 高温变性： 94-96℃ II. 退火： 50-65℃ III. 延伸： 72℃（普通taq）

实时荧光定量PCR(Rea1- time Quantitative pCr,qPCR) ◆是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监 测整个PCR进程,从而对起始模板进行定量分析的方法。 ◆实时荧光定量PcR过程中,荧光染料能特异性掺入DNA双链,发 出荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。 ◆实时荧光定量PCR技术是一次DNA定量技术的飞跃,运用该项技 术,可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析。 ◆mRNA一般先反转录为cDNA后再进行PCR扩增,从cDNA的水平来反 映mRN的表达水平,所以常称为 qRT-PCR,或简称qPCR

实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR） 是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监 测整个PCR进程，从而对起始模板进行定量分析的方法。 实时荧光定量PCR过程中，荧光染料能特异性掺入DNA双链，发 出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。 实时荧光定量PCR技术是一次DNA定量技术的飞跃，运用该项技 术，可以对DNA 、RNA样品进行定量和定性分析。 mRNA一般先反转录为cDNA后再进行PCR扩增，从cDNA的水平来反 映mRNA的表达水平，所以常称为qRT-PCR，或简称qPCR

SYBR Green与DNA双螺旋小沟区域结合 荧光染料 SYBR Green能特异性掺入DNA双链,发出荧光信号,而不掺 入双链中的染料分子不发出荧光信号,从而保证荧光信号的增加与 PCR产物增加完全同步

SYBR Green 与DNA双螺旋小沟区域结合 荧光染料SYBR Green能特异性掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺 入双链中的染料分子不发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR产物增加完全同步

SYBR Green作用原理示意图 热变性 FF 引物 荧光物质 引物退火 DNA聚合酶B LLLLLLLL 延伸反应 玉

SYBR Green作用原理示意图

通过检测每个循环的荧光强度,使PCR产物的实时检测成为可能,并使用 Ct值进行分析。Ct值( Cycle threshold)就是在荧光PCR扩增过程 中,当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。 0.075 茭光基团 0.05 国0aC值 荧光阈值 TNNNNNA 10 y 焚光检测元件

通过检测每个循环的荧光强度，使PCR产物的实时检测成为可能,并使用 Ct值进行分析。 Ct值（Cycle threshold）就是在荧光 PCR 扩增过程 中,当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。 荧光阈值

几个概念: 荧光阈值:是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,荧光信号超过阈 值的才是真正的信号。荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光 信号的标准偏差的10倍(机器自动设置)。也可以采用手动设置荧光 阈值,要尽量选择进入指数期的最初阶段 n基线:是指在F时增反应的最 初数个循环里,荧光信号变化不 对数期 大。接近一条直线,这样的直线 Y=x(1+e) 即是基线。我们一般把荧光PCR ct值 荧光阈值 的前15个循环信号作为荧光本 底信号aine基线期),是测 基线期 量的偶然误差造成的。 荧光定量PCR扩增曲线示意图

几个概念： 荧光定量PCR扩增曲线示意图 • 荧光阈值：是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，荧光信号超过阈 值的才是真正的信号。荧光域值的缺省设置是 3 ～ 15 个循环的荧光 信号的标准偏差的10倍 (机器自动设置)。也可以采用手动设置荧光 阈值，要尽量选择进入指数期的最初阶段。 基线：是指在PCR扩增反应的最 初数个循环里，荧光信号变化不 大。接近一条直线，这样的直线 即是基线。我们一般把荧光 PCR 的前 15个循环信号作为荧光本 底信号(baseline,基线期),是测 量的偶然误差造成的。 Y=x(1+e)n 线性期