复旦大学：《分子生物学理论与实验》教学课件_实验七、八 荧光原位杂交实验 fluorescent in situ hybridization，FISH

荧光原位杂交实验 (fluorescent in situ hybridization, FISH) 潘銮凤王松梅 Ifpanashmu. edu. cn smwang2@fudan.edu.cn

荧光原位杂交实验 （fluorescent in situ hybridization，FISH） 潘銮凤 王松梅 lfpan@shmu.edu.cn smwang2@fudan.edu.cn

、实验目的 FISH检测白血病细胞系H-60中的c-myc基因 扩增情况 ·掌握核酸杂交的基本原理、过程和操作 ·熟练掌握荧光显微镜的使用方法 掌握 Image J等软件进行图像融合的方法 ·理解荧光原位杂交技术的应用

一、实验目的 • 掌握核酸杂交的基本原理、过程和操作 • 熟练掌握荧光显微镜的使用方法 • 掌握Image J等软件进行图像融合的方法 • 理解荧光原位杂交技术的应用 FISH检测白血病细胞系HL-60中的c-myc基因 扩增情况

实验原理 ◆核酸杂交是以碱基互补为基础、以双链核酸分子在特定条件下的 变性和复性为手段,对核酸分子进行定性和定量检测 ◆两条互补的核苷酸单链在特定的条件下退火形成异质双链 待检基因 杂交探针: 核酸 基因组 变性 复性 CDNA RNA 寡核苷酸 杂交 杂交:碱基互补 >连续4bp形成双链 >连续17bp人基因特异杂交

二、实验原理  核酸杂交是以碱基互补为基础、以双链核酸分子在特定条件下的 变性和复性为手段，对核酸分子进行定性和定量检测  两条互补的核苷酸单链在特定的条件下退火形成异质双链 核酸 变性 待检基因 杂交探针： 基因组 cDNA RNA 寡核苷酸 杂交 杂交：碱基互补 >连续4bp形成双链 >连续17bp人基因特异杂交 复性

实验原理 核酸杂交方法 Southern blot: DNA Northern blot: rna 原位杂交:组织、细胞、菌落、染色体 斑点杂交( dot blotting) 液相杂交

二、实验原理  核酸杂交方法 • Southern blot: DNA • Northern blot: RNA • 原位杂交：组织、细胞、菌落、染色体 • 斑点杂交(dot blotting） • 液相杂交

原位杂交( in situ hybridization,SH ISH始于20世纪60年代,是分子生物学、组织化学、细胞学相 结合而产生的一门新兴技术 将标记的DNA或者RNA探针与细胞或组织中的核酸进行杂交,检 测与其互补的另一条链在细胞中的情况,包括扩增、易位、表 达等 原位杂交常用标记物质 放射性国同位素 70年代 3H、35s、125、32P等 放射科物80年代中后期 荧光素、生物素、地高辛等 直接FSH间接FSH:杂交后,以针对半抗原的荧光 物质标记的抗体进行探针检测

原位杂交（in situ hybridization,ISH) •ISH始于20世纪60年代，是分子生物学、组织化学、细胞学相 结合而产生的一门新兴技术 •将标记的DNA或者RNA探针与细胞或组织中的核酸进行杂交,检 测与其互补的另一条链在细胞中的情况，包括扩增、易位、表 达等

>荧光原位杂交( fluorescent in situ hybridization, FISH) 应用荧光染料标记探针DNA,变性成单链后与待检材料中 (细胞、组织)未知的单链核酸进行特异性结合,形成可被检 测的杂交双链核酸。在荧光显微镜下观察并记录结果。 标记荧光染料 变性&杂交 TX FISH原理示意图

 荧光原位杂交（ fluorescent in situ hybridization， FISH） • 应用荧光染料标记探针DNA，变性成单链后与待检材料中 （细胞、组织）未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检 测的杂交双链核酸。在荧光显微镜下观察并记录结果

染色体的5种探针 位点特异性探针 着丝粒探针染色体末端着色探针染色体臂探针全染色体着色探针 GLP CSP TPP APP WPP 过去制备分裂前期的染色体进行分析 现在可直接检测间期细胞的染色质

染色体的5种探针 过去制备分裂前期的染色体进行分析， 现在可直接检测间期细胞的染色质

Centromere 8q24 Telomere MYC csP8(绿色 500kb 200bp GLP MYC(红色) UCSC Genome Browser on Human Feb 2009(GRCh37hg 19) Assembly move>>>>>zoom in[ 1.5x 3x 10x base zoom out 1.5x 3x 10x100X chr8: 128, 555, 811-129,064, 392, 582 bp. enter position, gene symbol or search terms goMore on-site workshops ch(a4,21)[■pa ■■4 126,9,ee 129,秒6e,e ucec Genes (Refseq, Genbank, CCDs, R ns L Compar at ive Linked. fletch Pothol

Centromere 8q24 Telomere MYC CSP8(绿色) 200bp GLP MYC(红色) 500kb

制片 FISH基本实验过程 DNA 将探针置于载玻片上 RNA PNA 探针的制备与 加盖玻片 标记 在荧光显微镜下观察 变性 检测 杂交

探针的制备与 标记

、主要实验材料 防脱载玻片( premiere公司)、医用砂轮 ·20×20mm盖玻片 ·橡皮胶( rubber cement) ·平板加热器 杂交盒(饭盒) ·恒温水浴锅 ·玻璃染色缸 香柏油 ·荧光显微镜及拍照系统 MYC基因扩增检测试剂盒(广州安必平|BP)

三、主要实验材料 • 防脱载玻片（premiere公司）、医用砂轮 • 20×20mm盖玻片 • 橡皮胶（rubber cement） • 平板加热器 • 杂交盒（饭盒） • 恒温水浴锅 • 玻璃染色缸 • 香柏油 • 荧光显微镜及拍照系统 • MYC 基因扩增检测试剂盒（广州安必平IBP）