复旦大学：《分子生物学理论与实验》教学课件_实验三 细胞总RNA的提取及逆转录

实验三、四说明(讲义中实验15、16和17) 通过实验三、四,观察c-myc小分子抑制剂10058F4 对H60细胞中c-myc基因mRNA表达水平的影响 目的基因mRNA表达水平分析流程 RNA Realtime 反转录 提取

实验三、四说明（讲义中实验15、16和17） 通过实验三、四，观察 c-myc小分子抑制剂10058-F4 对HL60细胞中c-myc基因mRNA表达水平的影响 RNA 提取 反转录 RealTime PCR 数据 分析 目的基因mRNA表达水平分析流程

实验三细胞总RNA的提取及反转录

实验三 细胞总RNA的提取及反转录

实验目的

实验目的 1

实验目的 掌握用 Triz1试剂抽提细胞总RNA 以所抽提的细胞总RN为模板合成cDNA第一链

实验目的 掌握用Trizol试剂抽提细胞总RNA 以所抽提的细胞总RNA为模板合成cDNA第一链

实验原理 (一) Trizol法抽提细胞总RNA

2 （一） Trizol法抽提细胞总RNA 实验原理

RNA提取的基本原理 细胞或组织 有效破碎 核酸(DNA与RNA)-蛋白质复合物 RNA与DNA、蛋白质和多糖等分开 水相中的RNA 异丙醇 RNA沉淀,用 RNase free water溶解

RNA提取的基本原理 细胞或组织 有效破碎 核酸 (DNA与RNA)-蛋白质复合物 RNA与DNA、蛋白质和多糖等分开 水相中的RNA 异丙醇 RNA沉淀，用RNase free water溶解

TRizol抽提RNA的方法:(异硫氰酸胍-酚氯仿抽提法) Dr Piotr Chomczynski Dr Nicoletta sacchi Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. 1987

TRizol抽提RNA的方法：（异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法 ） Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate￾phenol-chloroform extraction. 1987 Dr. Nicoletta Sacchi

TRIzol作用原理 Triz1能迅速裂解细胞,使核酸得到释放,并保持RNA的完 整性。加入氯仿离心后,裂解液分离成水相和有机相。RNA 存在于水相,通过异丙醇沉淀回收。 ◆试剂主要成分是酚和异硫氰酸胍,酚可有效的变性蛋白质, 但是酚不能完全抑制RNA酶活性。酚含0.1%的8-羟基喹啉, 防止酚被氧化。 ◆酚与氯仿联合使用可增强对 RNase的抑制 ◆异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可 溶解蛋白质,并使蛋白质二级结构消失,细胞结构降解, 核蛋白迅速与核酸分离。抑制RNA酶活性 ◆β-巯基乙醇主要破坏 RNase蛋白质中的二硫键

TRIzol作用原理 Trizol 能迅速裂解细胞，使核酸得到释放，并保持RNA的完 整性。加入氯仿离心后，裂解液分离成水相和有机相。RNA 存在于水相，通过异丙醇沉淀回收。 试剂主要成分是酚和异硫氰酸胍，酚可有效的变性蛋白质， 但是酚不能完全抑制RNA酶活性。酚含0.1%的8-羟基喹啉， 防止酚被氧化。 酚与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可 溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解， 核蛋白迅速与核酸分离。抑制RNA酶活性 β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键

提到Tzol想必大家最容易联想到的就 是 Invitrogen(现在的ife)公司,而实 际上TRzo的品牌是由美国MRC ( Molecular research center)公司持 有,该公司持有的其他著名商标还包括 FORMAzo, DNAzol等。当然该试剂也 kzol Reag 在 invitrogen公司的推动下成为经典, 015960 050175111 其他公司代理该品牌的公司如sgma公 司的 TRI Reagent。除此以外,一些其他 试剂厂商也纷纷推出类似的产品,比较 有代表性的就是宝生物推出的 IRNAiso以 及 Promega的 RNAgents等

提到Trizol想必大家最容易联想到的就 是invitrogen（现在的life）公司，而实 际上TRIzol的品牌是由美国MRC （Molecular Research Center）公司持 有，该公司持有的其他著名商标还包括 FORMAzol，DNAzol等。当然该试剂也 在invitrogen公司的推动下成为经典， 其他公司代理该品牌的公司如Sigma公 司的TRI Reagent。除此以外，一些其他 试剂厂商也纷纷推出类似的产品，比较 有代表性的就是宝生物推出的RNAiso以 及Promega的RNAgents等

实验原理 (二)反转录合成cDNA第一链

（二） 反转录合成cDNA第一链 实验原理 2