复旦大学：《分子生物学理论与实验》教学课件_实验六 蛋白质的SDS-PAGE分离及转膜

蛋白质的SDS-PAGE分离及转膜 复旦大学基础医学院医学实验教学中心 王松梅 021-54237330;smwang2@fudan.edu.cn

蛋白质的SDS-PAGE分离及转膜 复旦大学基础医学院医学实验教学中心 王松梅 021-54237330; smwang2@fudan.edu.cn •1

实验目的 .掌握 SDS-PAGE分离蛋白质的原理和技术 2.掌握半干转移的操作和 Western Blot的原理和技术

一、实验目的 1. 掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理和技术 2. 掌握半干转移的操作和Western Blot 的原理和技术 •2

、实验原理 SDS-PAGE电泳(不连续系统 2.转膜(半干转移法)

二、实验原理 1. SDS-PAGE电泳(不连续系统) 2. 转膜(半干转移法) •3

1 SDS-PAGE分离蛋白质 SDS的作用 ①裂解细胞膜、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋 白分子内的疏水作用、去多肽折叠 ②蛋白质SS复合物(1g:1.4g),长椭圆棒形 掩盖了蛋白质原有电荷差别 迁移率是分子量的函数

1.SDS-PAGE分离蛋白质 •4 SDS的作用: ① 裂解细胞膜、解离蛋白质之间的氢键、 取消蛋 白分子内的疏水作用、去多肽折叠 ②蛋白质-SDS复合物（1g : 1.4g）,长椭圆棒形 掩盖了蛋白质原有电荷差别 迁移率是分子量的函数

1 SDS-PAGE分离蛋白质 不连续体系由电泳缓冲液,浓缩胶,分离胶组成 1)浓缩胶为大孔径胶,凝胶缓冲液PH67的Tris-Hc 2)分离胶为小孔径胶,凝胶缓冲液PH89的Trs-HC 3)电泳缓冲液PH83的Trs甘氨酸缓冲液

1.SDS-PAGE分离蛋白质 不连续体系由电泳缓冲液，浓缩胶，分离胶组成 1）浓缩胶为大孔径胶，凝胶缓冲液PH6.7的Tris-HCI 2）分离胶为小孔径胶，凝胶缓冲液PH8.9的Tris-HCI 3）电泳缓冲液PH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液 •5

NH..COO sDS蛋白复合物 浓缩胶(浓缩效应) SDS蛋白复合物 NH2CH2CO}分离胶分子筛效应)

•6 --------NH2CH2COO- ------- Cl￾SDS-蛋白复合物 浓缩胶(浓缩效应) ------- Cl￾SDS-蛋白复合物 分离胶(分子筛效应) -------NH2CH2COO-

2转膜(半干转移) 蛋白质带负电,电场中会往正极移动 PVDF膜在凝胶和正极之间,将蛋白质拦截在膜上 PVDF膜可以牢固吸附蛋白质,使蛋白质保留在膜上

2.转膜(半干转移) • 蛋白质带负电，电场中会往正极移动 • PVDF膜在凝胶和正极之间，将蛋白质拦截在膜上 • PVDF膜可以牢固吸附蛋白质，使蛋白质保留在膜上 •7

转膜 半干转移“三明治” 安全盖 平板阴极(带闭锁) 增厚滤纸 丙烯酰胺凝胶 转印膜 电流方向 增厚滤纸 平板阳极 底座

•8 • 转膜 半干转移“三明治” 电流方向

三、电泳槽 电泳仪总成 垂直电泳槽

三、电泳槽 垂直电泳槽 •9

玻璃板梳子起胶板 10

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