复旦大学：《分子生物学理论与实验》教学课件_常用技术 第二章 核酸杂交技术 nucleic acid hybridization

常用技术第二章核酸杂交技术 nucleic acid hybridization 潘銮凤Ifpan@shu.edu.cn

常用技术第二章 核酸杂交技术 nucleic acid hybridization 潘銮凤 lfpan@shmu.edu.cn

第一节核酸杂交原理 及探针的制备

第一节 核酸杂交原理 及探针的制备

/一、实验原理 待检基因w核 杂交探针: 基因组 复性 酸变 CDNA RNA √性 寡核苷酸 杂交:碱基互补,>连续4bp形成双链 连续17bp人基因特异杂交

一、实验原理 核 酸 变 性 待检基因 杂交探针： 基因组 cDNA RNA 寡核苷酸 复性 杂交：碱基互补，>连续4bp形成双链 >连续17bp人基因特异杂交

傅/二、DNA的变性( (denaturation) 在一定条件下,DNA双链间的氢键断裂, 最后双链分开成为无规则线团,而核酸单链分 子中的所有共价键则不受影响,称为DNA变性。 DNA变性的常用方法: 1)热变性 2)酸、碱变性:pH10 3)化学试剂:尿素、甲酰胺、甲醛等

二、DNA的变性 (denaturation) 在一定条件下，DNA双链间的氢键断裂， 最后双链分开成为无规则线团，而核酸单链分 子中的所有共价键则不受影响, 称为DNA变性。 DNA变性的常用方法： 1）热变性 2）酸、碱变性：pH10 3）化学试剂：尿素、甲酰胺、甲醛等

退火 退火 双螺旋DNA 加热 部分解链加热 单股随机卷出 图7-1DNA变性和复性

DNA的二级结构 T A H CHz G HH CH 磷酸 H-N 二酯键 H G N-H C H CH -OP=0 CH T CH2

DNA的二级结构 磷酸 二酯键 +H × OH ×

DNA变性后性质变化: 1)粘度降低2)密度增加 3)A260增加:增色效应( hyperchromicity Single stranded helical 260 300 Wavelength (nm)

DNA变性后性质变化： 1) 粘度降低 2) 密度增加 3) A260增加：增色效应（hyperchromicity)

0.65 8包含较少的G0 两种不同 G0含量的 0.60 处的吸光率 包含较多的(+0)DM分子加 温时吸光率 变化的对比 055 050 Im"77C 83° 76 88 7075 8590 温度 DNA解链曲线(A)Tm与(G+C)%的关系(B)

熔解温度Tm: melting temperature Tm(℃)=0.4×(G+C)%+693 Tm(℃)=815+0.41×(G+C%-650/L-m% +16.6×lgM-0.72×甲酰胺% M:单价阳离子浓度,L:双链长度(bp)

熔解温度 Tm: melting temperature Tm(℃)=0.41×(G+C)%+69.3 Tm(℃)=81.5+0.41×(G+C)% -650/L－m％ +16.6×lgM -0.72×甲酰胺% M：单价阳离子浓度，L：双链长度（bp）

、DNA复性与核酸杂交 分开的双链在变性条件除去后能重新 按碱基互补的原则以氢键相连形成双链 DNA分子,这一过程称作DNA复性 ( renaturation)或退火( annealing)

三、DNA复性与核酸杂交 分开的双链在变性条件除去后能重新 按碱基互补的原则以氢键相连形成双链 DNA分子，这一过程称作DNA复性 (renaturation)或退火（annealing）