复旦大学：《分子生物学理论与实验》教学课件_实验五 细胞总蛋白的提取及聚丙烯酰胺凝胶的制备

Western Blot 细胞总蛋白的提取及聚丙烯酰胺凝胶的制备 复旦大学基础医学院医学实验教学中心 王松梅 021-54237330;smwang2@fudan.edu.cn

Western Blot（一） 细胞总蛋白的提取及聚丙烯酰胺凝胶的制备 复旦大学基础医学院医学实验教学中心 王松梅 021-54237330; smwang2@fudan.edu.cn •1

实验目的 1.掌握SDS直接裂解细胞法提取蛋白质 2.掌握Lowy法测定蛋白质浓度的原理 3.掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理和制胶操作技术

一、实验目的 1. 掌握SDS直接裂解细胞法提取蛋白质 2. 掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理 3. 掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理和制胶操作技术 •2

Western Blot的过程 HL60细胞 聚丙烯酰胺凝胶的制备7次实验内容 [总蛋白质制备 细胞裂解—蛋白质溶液 SDS-PAGE分离蛋白质 SDS蛋白质复合物→→蛋白分离形成条带 转膜 蛋白质 凝胶 PVDF膜 1.封闭 2.一抗结合 在PVDF膜上鉴定cmyc蛋白 3.酶标二抗结合 4.显色

Western Blot的过程 总蛋白质制备 细胞裂解 蛋白质溶液 SDS-PAGE分离蛋白质 SDS-蛋白质复合物 蛋白分离形成条带 蛋白质 转膜 凝胶 PVDF膜 在PVDF膜上鉴定c-myc蛋白 •3 1. 封闭 2. 一抗结合 3. 酶标二抗结合 4. 显色 HL60细胞 聚丙烯酰胺凝胶的制备 本次实验内容

、实验原理 细胞总蛋白的制备(SDS裂解法) 2. SDS-PAGE电泳(不连续系统 3.转膜(半干转移法) 4.在PVDF膜上鉴定蛋白质(抗原-抗体反应)

二、实验原理 1. 细胞总蛋白的制备(SDS裂解法) 2. SDS-PAGE电泳(不连续系统) 3. 转膜(半干转移法) 4. 在PVDF膜上鉴定蛋白质(抗原-抗体反应) •4

细胞总蛋白的制备 从细胞中提取出蛋白质的方法: 1)机械破碎:匀浆器,超声波,石英砂 2)去污剂:SDS,NP-40等 3)酶消化法:溶菌酶,纤维素酶 4)其他:高压挤压,反复冻融 从组织中提取蛋白质: 剪成小块,液氮中研磨,去污剂中溶解

细胞总蛋白的制备 从细胞中提取出蛋白质的方法： 1)机械破碎：匀浆器，超声波，石英砂 2)去污剂：SDS，NP-40等 3)酶消化法：溶菌酶，纤维素酶 4)其他：高压挤压，反复冻融 从组织中提取蛋白质： 剪成小块，液氮中研磨，去污剂中溶解 •5

owry法测定蛋白质浓度(Foin-酚试剂) 1)蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应,形成紫红色蛋 白质-铜复合物 2)紫红色复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸和 磷钨酸,产生深蓝色,呈色强度与蛋白质浓度呈正相关, 分光光度计测吸光度,做标准曲线

Lowry法测定蛋白质浓度（Folin-酚试剂） 1）蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色蛋 白质-铜复合物 2）紫红色复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸和 磷钨酸，产生深蓝色，呈色强度与蛋白质浓度呈正相关， 分光光度计测吸光度，做标准曲线 •6

三、电泳槽 电泳仪总成 垂直电泳槽

三、电泳槽 垂直电泳槽 •7

A本体 △ 学北京品生物术有限容司 制 玻璃板

•8 制胶器 玻璃板 本体

玻璃板梳子起胶板

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四、实验内容 制分离胶 细胞总蛋白的制备 制浓缩胶 余下步骤在下周 Western blot(二)及再下周 Western blot(三)完成 10

四、实验内容 •10 •制分离胶 •细胞总蛋白的制备 •制浓缩胶 •余下步骤在下周Western blot （二）及再下周 Western blot （三）完成