复旦大学：《医学生物学研究技术与实验》教学课件_实验 DNA重组与细胞转化

《医学生物学研究技术与实验》 实验课程部分 复旦大学上海医学院医学实验教学中心

实验一DNA重组与细胞转化 、实验目的 1.cacl2法制备感受态细胞(E. coli HB1101) 2.目的基因与载体的连接 (c-myc+pBR322;粘端连接) 3.重组质粒转化大肠杆菌并筛选转化体 (HB101; Ampr)

二、基因工程技术的基本内容 质粒载体(pBR322)的构建 目的基因(c-myc基因片段)的获取 载体与目的基因的连接(粘端连接) 重组体导入受体细胞(CaCl2法制备感受态细胞) 重组体的鉴定 目的基因在细胞中的表达 表达产物的分离、鉴定

Ecori Cla I Ecori Cla I 大肠杆菌HB101 pBR322 C-myc dna片段 CaCl,法 感受态细胞 1.4kb 转化 4.3kb 推板 TDNA连接酶 Amp平板 转化 ↓孵育过夜 4.3kb 5.7kb ④④题④题题

ECORI G AATT EcoRI 4359 ClaI. AT CGAT AmpR_promoter 4 粘性末端 防止载体的自身环化 目的基因定向插入 PVUII 2066 NdeI 2296 pGEX_3_primer pBR3质粒图谱

目的基因(c-myc基因片段)的获取 c-myc基因是myc基因家族的重要成员之 c-myc基因与多种肿瘤发生发展有关 本实验采用的cmyc基因来源于人类组织细胞的14kb 的DNA片段 ECoR I和CaI双酶切处理

敢体与目的基因的连接构建量组子 1.平端连接 增加DNA浓度或提高连接酶浓度以提高连接效率 2.粘端连接 效率较高,加入连接酶后可立即转化,即有转化子 出现 3粘-平连接 画④题④题题题

连接酶的选择: T4DNA连接酶(适用粘端、平端连接) 大肠杆菌DNA连接酶(只适用粘端连接) 连接温度: 般12~16℃ 载体与目的基因的比例: 摩尔比约1:1~1:5

转化:将异源DNA分子引入另一细胞,使受体 细胞获得新的遗传性状。 感受态细胞:受体细胞经特殊方法(如电击 CaCl2等处理,细胞膜的通透性发生改变,允许 带外源DNA的载体分子进入的状态,称之。 转化体的筛选:选择性培养基 如:Amp抗性平板

实验器材与试剂 (详见实验讲义)