复旦大学：《分子生物学理论与实验》教学课件_实验五 Western blot（一）

Western blot(一) 复旦大学基础医学院医学实验教学中心 潘銮凤 021-54237329;Ifpan@shmu.edu.cn

Western Blot（一） 复旦大学基础医学院医学实验教学中心 潘銮凤 021-54237329; lfpan@shmu.edu.cn •1

Western Blot 总蛋白质制备 细胞裂解—蛋白质溶液 SDS-PAGE分离蛋白质SDS蛋白质复合物→蛋白分离形成条带 转膜(印迹) 凝胶上蛋白质一→PVDF膜上 1.封闭 在PVDF膜上鉴定蛋白质 抗结合 3.酶标二抗结合 4.显色

Western Blot 总蛋白质制备 细胞裂解 蛋白质溶液 SDS-PAGE分离蛋白质 SDS-蛋白质复合物 蛋白分离形成条带 转膜（印迹） 凝胶上蛋白质 PVDF膜上 在PVDF膜上鉴定蛋白质 •2 1. 封闭 2. 一抗结合 3. 酶标二抗结合 4. 显色

实验目的 掌握RPA提取蛋白质的方法 2.掌握 Lowry法测定蛋白质浓度的原理 3.掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理和技术 4.掌握半干转移的操作和 Western blot的原理和技术

一、实验目的 1. 掌握RIPA提取蛋白质的方法 2. 掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理 3. 掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理和技术 4. 掌握半干转移的操作和Western Blot 的原理和技术 •3

实验原理 1.制备SDS聚丙烯酰胺凝胶 2.细胞总蛋白的制备(RPA裂解液) 3. SDS-PAGE电泳(不连续系统) 4.转膜(半干转移法) 5.在PVDF膜上鉴定蛋白质(抗原-抗体反应)

二、实验原理 1. 制备SDS聚丙烯酰胺凝胶 2. 细胞总蛋白的制备(RIPA裂解液) 3. SDS-PAGE电泳(不连续系统) 4. 转膜(半干转移法) 5. 在PVDF膜上鉴定蛋白质(抗原-抗体反应) •4

、实验内容 制分离胶 细胞总蛋白的制备 °制浓缩胶 上样电泳 染色 转膜(半干式转移) 闭 余下步骤在下周 Western blot(二)完成

三、实验内容 •5 •制分离胶 •细胞总蛋白的制备 •制浓缩胶 •上样电泳 •染色 •转膜 (半干式转移) •封闭 •余下步骤在下周Western blot （二）完成

四、上课过程 制分离胶 讲授实验原理和步骤 制浓缩胶 °细胞总蛋白的制备 午饭 上样电泳 °讲解剩下的步骤 染色 转膜(半干式转移) 封闭 °余下步骤在下周 Western blot(二)完成

四、上课过程 •6 •制分离胶 •讲授实验原理和步骤 •制浓缩胶 •细胞总蛋白的制备 •午饭 •上样电泳 •讲解剩下的步骤 •染色 •转膜 (半干式转移) •封闭 •余下步骤在下周Western blot （二）完成

1制备凝胶— BioRad 制备分离胶 制备浓缩胶 Fill to the top 0.5-1cm Stacker Solution 导插入梳子,待凝 去除梳子,上样电泳 ■ ILLLI 购买预制胶 Pull comb straight up to remove Mini-PROTEAN Tetra cell

•7 1.制备凝胶——BioRad 制备分离胶 插入梳子，待凝 去除梳子，上样电泳 制备浓缩胶 购买预制胶

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