《生物化学》课程实验指导书（共十个实验）

实验一、基本操作（准备刻度吸管、试管、试管刷、烧杯、洗耳球、洗涤剂及蒸馏水等）实验二、蛋白质的沉淀凝固[原理]蛋白质带有许多正负电荷，在水溶液中呈现两性电解质，又有许多亲水基团，因此其水溶液有一定的稳定性。但经某些方法处理后，破坏其电荷性及亲水性，蛋白质则又很易从溶液中沉淀出来。促使蛋白质沉淀的因素很多，大致可分两类：第一类是可逆的沉淀反应。这时蛋白质的空间构象未受到很大改变，除去沉淀因素后，可以重新溶解，例如盐析和低温乙醇沉淀蛋白。第二类是不可逆的沉淀反应，重金属盐类或生物碱试剂沉淀蛋白后，由于蛋白质结构发生重大改变，所以不再溶于水中。不可逆的蛋白质沉淀多表示蛋白质已经变性。变性的蛋白质在等电点附近加热时，蛋白质分子间相互盘绕而变成坚实的凝块。[试剂]1.5%蛋白质溶液：取出鸡蛋清用水稀释20倍，即相当5%蛋白质溶液。2.饱和硫酸铵溶液3.硫酸铵结晶粉末4.95%乙醇（AR）5.1%乙酸6.3%硝酸银溶液7.1%硫酸铜一、蛋白质的盐析[原理]用高浓度的中性盐，使蛋白质的荷电性受到破坏并能去掉蛋白质的水化膜，以致失去稳定性而沉出。由于蛋白质的组成不同，其性质便不相同，因而沉淀时所需中性盐的浓度也不相同。例如半饱和的硫酸铵只能沉淀球蛋白，饱和硫酸铵才能沉淀清蛋白。盐析沉淀蛋白质往往不引起变性，所以常用于分离各种天然蛋白质。[操作]1.取一试管，加入3毫升5%蛋白质溶液及3毫升饱和硫酸铵溶液，摇匀，此时溶液成为半饱和硫酸铵溶液。静置数分钟，有什么现象发生？析出的蛋白质沉淀是哪一种？2.将试管内容物过滤，加硫酸铵粉末于滤液中，使达到饱和状态，此时析出的蛋白质是哪一种？（注意固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆）

实验一、基本操作 （准备刻度吸管、试管、试管刷、烧杯、洗耳球、洗涤剂及蒸馏水等） 实验二、蛋白质的沉淀凝固 [原理] 蛋白质带有许多正负电荷，在水溶液中呈现两性电解质，又有许多亲水基团，因此其水溶液有一定的稳定性。但 经某些方法处理后，破坏其电荷性及亲水性，蛋白质则又很易从溶液中沉淀出来。促使蛋白质沉淀的因素很多，大致 可分两类： 第一类是可逆的沉淀反应。这时蛋白质的空间构象未受到很大改变，除去沉淀因素后，可以重新溶解，例如盐析 和低温乙醇沉淀蛋白。 第二类是不可逆的沉淀反应，重金属盐类或生物碱试剂沉淀蛋白后，由于蛋白质结构发生重大改变，所以不再溶 于水中。不可逆的蛋白质沉淀多表示蛋白质已经变性。变性的蛋白质在等电点附近加热时，蛋白质分子间相互盘绕而 变成坚实的凝块。 [试剂] 1．5％蛋白质溶液：取出鸡蛋清用水稀释 20 倍，即相当 5％蛋白质溶液。 2．饱和硫酸铵溶液 3. 硫酸铵结晶粉末 4. 95％乙醇（AR） 5．1％乙酸 6．3％硝酸银溶液 7．1％硫酸铜 一、蛋白质的盐析 [原理] 用高浓度的中性盐，使蛋白质的荷电性受到破坏并能去掉蛋白质的水化膜，以致失去稳定性而沉出。由于蛋白质 的组成不同，其性质便不相同，因而沉淀时所需中性盐的浓度也不相同。例如半饱和的硫酸铵只能沉淀球蛋白，饱和 硫酸铵才能沉淀清蛋白。盐析沉淀蛋白质往往不引起变性，所以常用于分离各种天然蛋白质。 [操作] 1．取一试管，加入 3 毫升 5％蛋白质溶液及 3 毫升饱和硫酸铵溶液，摇匀，此时溶液成为半饱和硫酸铵溶液。静 置数分钟，有什么现象发生？析出的蛋白质沉淀是哪一种？ 2．将试管内容物过滤，加硫酸铵粉末于滤液中，使达到饱和状态，此时析出的蛋白质是哪一种？ （注意固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆）

3.取上项混浊液，加10毫升水，观察沉淀是否复溶。二、乙醇沉淀蛋白质[原理]乙醇能够破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。在室温中乙醇与蛋白质接触较久后，可使之变性，形成不可逆的沉淀反应。但在低温下，可以避免乙醇的变性作用。[操作]1.试管4支，标以1、2、3、4号码，按下表操作：12试剂3411105%蛋白质溶液（ml）0001%乙酸（滴）1~2020095%乙醇（ml）2.将3管及4管置于冰盐浴中，冷却5分钟，然后将第4管的冰乙醇倒入第3管中并混匀（迅速观察）。同时向第1及第2管中各加入未冷却的95%乙醇2毫升混合均匀。观察各管中的沉淀情况并立即向第1、2及3管中各加入蒸馏水10毫升，混匀（注意：此步要求迅速），比较各管变化并解释之。三、重金属盐沉淀蛋白质[原理]在溶液的pH值大于蛋白质的等电点时，带负电荷的蛋白质与带正电荷的重金属离子结合成盐而沉出。[操作]取试管4支，按下表操作：1234试剂55555%蛋白质溶液（滴）00221%乙酸（滴）30301%硫酸铜（滴）03033%硝酸银（滴）混合均匀，比较各管混浊程度并稀释之。实验三双缩脲法测定蛋白质浓度[目的]掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准管法测物质含量的方法（绘制标准曲线）以及分光光度计的使用方法。[原理]双缩脲（NH2CONHCONH2）是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度

3．取上项混浊液，加 10 毫升水，观察沉淀是否复溶。 二、乙醇沉淀蛋白质 [原理] 乙醇能够破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。在室温中乙醇与蛋白质接触较久后，可使之变性，形成不可逆 的沉淀反应。但在低温下，可以避免乙醇的变性作用。 [操作] 1．试管 4 支，标以 1、2、3、4 号码，按下表操作： 试剂 1 2 3 4 5％蛋白质溶液（ml） 1 1 1 0 1％乙酸（滴） 0 1～2 0 0 95％乙醇（ml） 0 0 0 2 2．将 3 管及 4 管置于冰盐浴中，冷却 5 分钟，然后将第 4 管的冰乙醇倒入第 3 管中并混匀（迅速观察）。同时向 第 1 及第 2 管中各加入未冷却的 95％乙醇 2 毫升混合均匀。观察各管中的沉淀情况并立即向第 1、2 及 3 管中各加入蒸 馏水 10 毫升，混匀（注意：此步要求迅速），比较各管变化并解释之。 三、重金属盐沉淀蛋白质 [原理] 在溶液的 pH 值大于蛋白质的等电点时，带负电荷的蛋白质与带正电荷的重金属离子结合成盐而沉出。 [操作] 取试管 4 支，按下表操作: 试剂 1 2 3 4 5％蛋白质溶液（滴） 5 5 5 5 1％乙酸（滴） 0 0 2 2 1％硫酸铜（滴） 3 0 3 0 3％硝酸银（滴） 0 3 0 3 混合均匀，比较各管混浊程度并稀释之。 实验三 双缩脲法测定蛋白质浓度 [目的] 掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准管法测物质含量的方法（绘制标准曲线）以及分光光度计的使用方法。 [原理] 双缩脲(NH2CONHCONH2) 是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，此反 应称为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱 性溶液中也能与 Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色 法测定蛋白质浓度

双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONHz、-CH,NH,、-CS-NH,等基团也有此反应。[器材]分析天平、分光光度计、恒温水浴箱、试管、吸量管等[试剂]1.双缩脉试剂：称取1.5g硫酸铜（CuS04：5H20）和6.0g酒石酸钾钠（NaKC4H406·4H20）溶解于500ml蒸馅水中，在搅拌下加入300ml10%氢氧化钠溶液，用水稀释到1000ml，贮存于内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保存。2.0.9%NaC1（生理盐水）。3.蛋白质标准液（70g/L)：每100克蛋清中约含蛋白质10克~11克。用生理盐水对蛋清进行稀释配制成70g/L的溶液，作为蛋白质标准液。4.样品血清：兔血清用生理盐水稀释（10倍或20倍）后再测定，置于冰箱保存备用。[操作]取中试管3支，按下表操作：管号空白管标准管测定管70g/L蛋白溶液（ml）0.1一血清（ml）0.1--0.1 生理盐水（ml）-一双缩脲试剂（ml）4.04.04.0各管混匀、放置37℃水浴中保温15分钟。用540nm比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。[计算]血清中蛋白质含量（g/L)=（A测/A标）XC标×血清的稀释倍数实验四、还原糖含量的测定（35一二硝基水杨酸法）[目的要求]了解和掌握还原糖含量测定的原理和方法。[实验原理]在NaOH存在下，3,5一二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成棕红色的氨基化合物，该有色化合物在540nm处具有稳定的吸收峰。在一定的浓度范围内，还原糖的量和棕红色物的颜色深浅呈一定比例关系，且还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中还原糖的含量。[试剂]1.3,5一二硝基水杨酸（DNS）试剂

双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差， 而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2 等基团也有此反应。 [器材] 分析天平、分光光度计、 恒温水浴箱、 试管、 吸量管等 [试剂] 1．双缩脲试剂：称取 1.5g 硫酸铜（CuSO4·5H2O）和 6.0g 酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）溶解于 500ml 蒸馏水 中，在搅拌下加入 300ml 10％氢氧化钠溶液，用水稀释到 1000ml，贮存于内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保存。 2．0.9％NaCl（生理盐水）。 3．蛋白质标准液(70g／L)：每 100 克蛋清中约含蛋白质 10 克~11 克。用生理盐水对蛋清进行稀释配制成 70g／L 的溶液,作为蛋白质标准液。 4．样品血清:兔血清用生理盐水稀释（10 倍或 20 倍）后再测定，置于冰箱保存备用。 [操作] 取中试管 3 支，按下表操作： 管号 空白管 标准管 测定管 70g／L 蛋白溶液（ml） — 0.1 — 血清（ml） — — 0.1 生理盐水（ml） 0.1 — — 双缩脲试剂（ml） 4.0 4.0 4.0 各管混匀、放置 37℃水浴中保温 15 分钟。用 540nm 比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。 [计算] 血清中蛋白质含量(g／L)=（A 测/A 标）×C 标×血清的稀释倍数 实验四、还原糖含量的测定（3,5－二硝基水杨酸法） [目的要求] 了解和掌握还原糖含量测定的原理和方法。 [实验原理] 在 NaOH 存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成棕红色的氨基化合物，该有色化合物在 540nm 处具有稳定的吸收峰。在一定的浓度范围内，还原糖的量和棕红色物的颜色深浅呈一定比例关系，且还原糖的量 与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中还原糖的含量。 [试剂] 1. 3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂

6.3gDNS和262ml的2mo1/L氢氧化钠，加到500ml含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加上5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容到1000m，置手棕色瓶中。2.葡萄糖标准溶液（1mg/ml）精密称取已经干燥恒重的葡萄糖1g，加少量水溶解后再加8ml的12mo1/L浓盐酸（防止微生物生长），用蒸馏水定容到1000ml。[操作]取3支试管，按下表操作：管号空白管标准管测定管0.2Glc标准液（ml）一I0. 2待测液（ml）一一0.2蒸馏水（ml）一一1. 03，5一二硝基水杨酸试剂（ml）1.01. 0混合均匀，沸水浴加热5分钟，取出，用水冷却，再分别加水4.0ml置于分光光度计上，用空白管调零，在540nm处测定吸光度值。[计算]待测液中还原糖的含量（mg/ml)=（A/A标）XC标实验五、尿淀粉酶活性的测定（Winslow氏法）【实验目的]1.熟悉酶活力单位等的定义。2.掌握尿淀粉酶活性的测定的原理和方法。[原理]酶催化一定化学反应的进行，酶含量极微，其绝对量不易测知，通常测一定条件下，酶所催化的反应速度，称为酶活性。临床上常用Wins1ow氏法测定尿或血清中淀粉酶活性。该法对淀粉酶活性单位的规定是：在37℃，C1-存在下，30分钟内能将0.1%淀粉溶液1ml水解的酶量定为淀粉酶的一个活性单位。[试剂]1.0.9%NaC12.稀碘液（0.01mol/L）3.0.1%淀粉溶液：准确称取可溶淀粉1.0g，放烧杯中加少量蒸馏水（约5m1），调成糊状，向烧杯中倾入刚煮沸的蒸馏水约100ml。随加随搅拌，应呈近乎透明的均匀溶液，否则继续煮沸1分钟，冷至室温移入1000ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度。[器材]37℃恒温水浴箱、中试管10支、刻度吸管1ml，10ml（各2支[操作]

6.3g DNS 和 262ml 的 2mol/L 氢氧化钠，加到 500ml 含有 182g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加上 5g 重蒸酚和 5g 亚硫 酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容到 1000ml,置于棕色瓶中。 2.葡萄糖标准溶液（1mg/ml） 精密称取已经干燥恒重的葡萄糖 1g,加少量水溶解后再加 8ml 的 12mol/L 浓盐酸（防止微生物生长），用蒸馏水定容到 1000ml。 [操作] 取 3 支试管，按下表操作： 管号 空白管 标准管 测定管 Glc 标准液（ml） — 0.2 — 待测液（ml） — — 0.2 蒸馏水（ml） 0.2 — — 3,5－二硝基水杨酸试剂（ml） 1.0 1.0 1.0 混合均匀,沸水浴加热 5 分钟，取出，用水冷却，再分别加水 4.0ml 置于分光光度计上，用空白管调零，在 540nm 处测定吸光度值。 [计算] 待测液中还原糖的含量(mg/ml)=（A 测/A 标）×C 标 实验五、尿淀粉酶活性的测定（Winslow 氏法） [实验目的] 1.熟悉酶活力单位等的定义。 2.掌握尿淀粉酶活性的测定的原理和方法。 [原理] 酶催化一定化学反应的进行，酶含量极微，其绝对量不易测知，通常测一定条件下，酶所催化的反应速度，称为 酶活性。临床上常用 Winslow 氏法测定尿或血清中淀粉酶活性。该法对淀粉酶活性单位的规定是：在 37℃，Cl－存在下， 30 分钟内能将 0.1％淀粉溶液 1ml 水解的酶量定为淀粉酶的一个活性单位。 [试剂] 1．0.9％NaCl 2．稀碘液（0.01mol/L） 3．0.1％淀粉溶液：准确称取可溶淀粉 1.0g，放烧杯中加少量蒸馏水（约 5ml），调成糊状，向烧杯中倾入刚煮沸 的蒸馏水约 100ml。随加随搅拌，应呈近乎透明的均匀溶液，否则继续煮沸 1 分钟，冷至室温移入 1000ml 容量瓶中， 加蒸馏水稀释至刻度。 [器材] 37℃恒温水浴箱、中试管 10 支、刻度吸管 1ml，10ml（各 2 支） [操作]

1.取10支试管，按顺序标记（1～10），各加1ml0.9%NaC1。2.用刻度吸管向第1管中加尿液1ml，使与0.9%NaC1混合均匀后，用同一吸管吸取混合液1ml移入第2试管中。3.用同法处理第2管，即混匀后从第2试管中吸取混合液1ml，移入第3试管中，依次类推，如此继续稀释至第9管，从第9管中吸出1ml弃去，这样即可获得分别含尿液为1/2、1/4、1/8....·1/512的不同浓度的尿稀释液（倍倍稀释法）。第10管不加尿液作为对照管。4.第10管起，依次迅速准确各加入0.1%淀粉溶液1ml迅速摇匀，移至37℃水浴中，保温30分钟。5.保温30分钟后，立即取出各管，向各管中迅速加入稀碘液2滴，摇匀，观察各管的颜色。各试管中出现由黄到蓝的色序。黄色表明无淀粉存在，仅呈碘颜色，淀粉遇碘呈蓝色，蓝色或紫红色表示尚有未水解的淀粉存在，淀粉的水解产物糊精遇碘呈红色。故呈黄到红色的各管，表示淀粉已被尿液中的淀粉酶水解。[注]本实验要求0.9%NaCl，0.1%淀粉溶液用10ml刻度吸管吸量。[计算]找出不带蓝色调的尿稀释倍数最大的管，例如第5管，已知在第5管内含尿液1/2ml。即1/32ml尿液也能在37℃，30分钟水解0.1%淀粉溶液1ml，求出1ml尿液水解0.1%淀粉溶液Xml。即每毫升尿液中所含淀粉酶的活性为32个活性单位。[临床意义]正常人的尿中含很少量的由胰腺及睡液腺分泌的淀粉酶，通常1ml尿液所含淀粉酶为8～64单位，但胰腺炎、腮腺炎、胆道疾患时排出增多，因此，测定尿中淀粉酶的活性具有临床诊断价值。实验六、血清尿素氮含量的测定（二乙酰一法）[目的]掌握测定血清尿素氮的原理和方法。[原理]尿素是体内氨基酸分解代谢的最终产物之一。氨基酸经脱氨基作用生成氨，氨对动物机体具有毒性。肝细胞具有使氨生成尿素的作用，所以尿素的生成是肝脏的解毒功能之一。肝脏合成的尿素通过血液运输至肾脏，由尿液中排出体外。所以血中尿素的来源是肝脏，而去路是通过肾脏的排泄作用。利用血液及尿中尿素氮含量可作为肾脏排泄功能的检验。本实验采用二乙酰一法测定血清尿素氮，测定血清或血浆尿素氮的正常值为5～19mg/100ml。二乙酰一法系根据双乙酰与尿素形成二嗪衍生物的有色复合物的显色反应。由手双乙酰本身不稳定，故用二乙酰一来代替，其反应式如下：i NOH00CH,-I-T-CH, + H.O -H CH,-I_T-CH, + NH:OH二乙酰-肟双乙酰羟胺NHz10CH,H+C=OCH,-C-C-CH, +C=N+ 2H,OC=CNH.C=NCH,双乙酰尿素二衍生物（有色复合物）

1．取 10 支试管，按顺序标记（1～10），各加 1ml 0.9％NaCl。 2．用刻度吸管向第 1 管中加尿液 1ml，使与 0.9％NaCl 混合均匀后，用同一吸管吸取混合液 1ml 移入第 2 试管中。 3．用同法处理第 2 管，即混匀后从第 2 试管中吸取混合液 1ml，移入第 3 试管中，依次类推，如此继续稀释至第 9 管，从第 9 管中吸出 1ml 弃去，这样即可获得分别含尿液为 1/2、1/4、1/8.1/512 的不同浓度的尿稀释液（倍倍 稀释法）。第 10 管不加尿液作为对照管。 4．第 10 管起，依次迅速准确各加入 0.1％淀粉溶液 1ml 迅速摇匀，移至 37℃水浴中，保温 30 分钟。 5．保温 30 分钟后，立即取出各管，向各管中迅速加入稀碘液 2 滴，摇匀，观察各管的颜色。 各试管中出现由黄到蓝的色序。黄色表明无淀粉存在，仅呈碘颜色，淀粉遇碘呈蓝色，蓝色或紫红色表示尚有未 水解的淀粉存在，淀粉的水解产物糊精遇碘呈红色。故呈黄到红色的各管，表示淀粉已被尿液中的淀粉酶水解。 [注]本实验要求 0.9％NaCl，0.1％淀粉溶液用 10ml 刻度吸管吸量。 [计算] 找出不带蓝色调的尿稀释倍数最大的管，例如第 5 管，已知在第 5 管内含尿液 1/2 5 ml。 即 1/32ml 尿液也能在 37℃，30 分钟水解 0.1％淀粉溶液 1ml，求出 1ml 尿液水解 0.1％淀粉溶液 Xml。 即每毫升尿液中所含淀粉酶的活性为 32 个活性单位。 [临床意义] 正常人的尿中含很少量的由胰腺及唾液腺分泌的淀粉酶，通常 1ml 尿液所含淀粉酶为 8～64 单位，但胰腺炎、腮 腺炎、胆道疾患时排出增多，因此，测定尿中淀粉酶的活性具有临床诊断价值。 实验六、血清尿素氮含量的测定（二乙酰一肟法） [目的] 掌握测定血清尿素氮的原理和方法。 [原理] 尿素是体内氨基酸分解代谢的最终产物之一。氨基酸经脱氨基作用生成氨，氨对动物机体具有毒性。肝细胞具有 使氨生成尿素的作用，所以尿素的生成是肝脏的解毒功能之一。肝脏合成的尿素通过血液运输至肾脏，由尿液中排出 体外。所以血中尿素的来源是肝脏，而去路是通过肾脏的排泄作用。利用血液及尿中尿素氮含量可作为肾脏排泄功能 的检验。 本实验采用二乙酰一肟法测定血清尿素氮，测定血清或血浆尿素氮的正常值为 5～19mg/100ml。二乙酰一肟法系 根据双乙酰与尿素形成二嗪衍生物的有色复合物的显色反应。由于双乙酰本身不稳定，故用二乙酰一肟来代替，其反 应式如下：

二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰不稳定，故由试剂中二乙酰一与强酸作用产生二乙酰。由于反应在强酸中进行，所产生的羟胺是干扰物质，所以必须用氧化剂将其氧化除去。可用的氧化剂有过硫酸盐、砷酸、过氧酸、氯胺T等。另外，在显色反应中产生的有色复合物对光不稳定，加入硫氨脲能增加其显色稳定性，又能提高尿素与双乙酰反应的灵敏度。硫氨脲和镉离子结合使用更能提高灵敏度。[试剂与器材]试剂1、尿素氮试剂（酸性试剂）：在1L容量瓶中加入蒸馏水约100ml，然后加入浓硫酸44ml及85%磷酸66ml冷却至室温后，加入硫氨脲50mg，及硫酸镉（3CbS04·8Ho）2g，溶解后用蒸馏水稀释至1L刻度。置于棕色瓶中放冰箱内可用半年不变。2、2%二乙酰一试剂：称取二乙酰一20g。加入蒸馏水约900ml，溶解后再用蒸馏水稀释至1L，贮于棕色瓶中置冰箱内半年不变。3、尿素氮标准液（60mg/100ml）：精确称取干燥纯尿素128.4mg，加蒸馏水溶解后转移入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至100ml刻度。加氯仿6滴作防腐剂，贮存于冰箱中保存半年不变。【操作】1.样品的测定取试管二支，标记为空白管和测定管，按表操作。混合后置沸水浴中煮沸12分钟，取出在冷水中冷却5分钟，于比色计中在540nm进行比色，以空白管调零点，读测定管光密度，查标准曲线即可查得血清尿素氮浓度。管号空白管测定管5.05. 0尿素氮试剂（ul）20血清或血浆（ul)一20蒸馏水（ul）二乙酰一（ul）0. 50. 52.尿素氮标准曲线制备取试管4支，按下表配制稀释标准液。1234试管编号1.02.03.04.060mg尿素氮标准液（ml）5. 04. 03.02. 0蒸馏水（ml）20301040相当于尿素氮浓度mg%另取5支试管，按下表加入各种试剂：24135试管编号5.05.05. 05.05. 0尿素氮试剂（ml）20202020/上述1～4管稀释尿素氮标准液（ul）20蒸馏水（ul）I---0. 5二乙酰一（ml）0.50. 50. 50. 5每次测定样品最好同时作一个30mg/100ml标准管，观察结果是否与标准曲线相符合，如不符合应检查原因，必要时应重新测定

二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的 4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰 不稳定，故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用产生二乙酰。 由于反应在强酸中进行，所产生的羟胺是干扰物质，所以必须用氧化剂将其氧化除去。可用的氧化剂有过硫酸盐、 砷酸、过氧酸、氯胺 T 等。另外，在显色反应中产生的有色复合物对光不稳定，加入硫氨脲能增加其显色稳定性，又 能提高尿素与双乙酰反应的灵敏度。硫氨脲和镉离子结合使用更能提高灵敏度。 [试剂与器材] 试剂 1、尿素氮试剂（酸性试剂）：在 1L 容量瓶中加入蒸馏水约 100ml，然后加入浓硫酸 44ml 及 85％磷酸 66ml 冷却至 室温后，加入硫氨脲 50mg，及硫酸镉（3CbSO4·8 Ho）2g，溶解后用蒸馏水稀释至 1L 刻度。置于棕色瓶中放冰箱内可 用半年不变。 2、2％二乙酰一肟试剂：称取二乙酰一肟 20g。加入蒸馏水约 900ml，溶解后再用蒸馏水稀释至 1L，贮于棕色瓶 中置冰箱内半年不变。 3、尿素氮标准液（60mg/100ml）:精确称取干燥纯尿素 128.4mg，加蒸馏水溶解后转移入 100ml 容量瓶中，用蒸 馏水稀释至 100ml 刻度。加氯仿 6 滴作防腐剂，贮存于冰箱中保存半年不变。 【操作】 1．样品的测定 取试管二支，标记为空白管和测定管，按表操作。混合后置沸水浴中煮沸 12 分钟，取出在冷水中冷却 5 分钟，于 比色计中在 540nm 进行比色，以空白管调零点，读测定管光密度，查标准曲线即可查得血清尿素氮浓度。 管号 空白管 测定管 尿素氮试剂（ul） 5.0 5.0 血清或血浆（ul） － 20 蒸馏水（ul） 20 － 二乙酰一肟（ul） 0.5 0.5 2．尿素氮标准曲线制备： 取试管 4 支，按下表配制稀释标准液。 试管编号 1 2 3 4 60mg 尿素氮标准液（ml） 1.0 2.0 3.0 4.0 蒸馏水（ml） 5.0 4.0 3.0 2.0 相当于尿素氮浓度 mg％ 10 20 30 40 另取 5 支试管，按下表加入各种试剂： 试管编号 1 2 3 4 5 尿素氮试剂（ml） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 上述 1～4 管稀释尿素氮标准液（ul） 20 20 20 20 － 蒸馏水（ul） － － － － 20 二乙酰一肟（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 每次测定样品最好同时作一个 30mg/100ml 标准管，观察结果是否与标准曲线相符合，如不符合应检查原因，必要 时应重新测定

[方法评估]尿素氮测定的方法有好多种，如次溴酸钠法、尿素酶法及二乙酰一法等，但生化检验常用的为尿素酶法及二乙酰一法。三乙酰一法试剂单一，方法简便，但试剂具毒性和腐蚀性，该方法易受标本混浊、黄疽、溶血等因素影响，操作时应注意。二乙酰一法的主要干扰来自血清中存在的含氮化合物。很多其它化合物在结构中会有尿素的残基，如瓜氨酸、四氧嘧啶和尿囊素，虽然也会产生一种带颜色的产物，但这些化合物在血清中浓度很低，故很少引起明显的干扰。另一些其它的化合物在血清中浓度高，但这些色素的最大吸收峰不同，因此不产生明显干扰。胆红素达171μmo1/L、血红蛋白达10g/L均无影响。[注意事项]1、由于反应在强酸中进行，产生的羟胺是干扰物质，所以必须用氧化剂将其氧化除去。提高酸的浓度可以提高显色反应的灵敏度。2.试剂中加入氨基硫脲和镉离子，可增进显色强度和色泽稳定性，但仍有轻度褪色现象，（每小时小于5%）。煮沸显色经冷却后，应及时比色。3、如血浆或血清尿素氮浓度超过40mg/100m时，则必须将标本用生理盐水稀释后再操作，结果乘稀释倍数。4.尿素浓度以前习惯用尿素氮mg/dl表示，因为一个尿素分子中有2个氮原子，所以1mmol尿素相当于28mg尿素氮（1mmol/L尿素相当于2.8mg/dL尿素氮）；另外还有以尿素氮mmol/L表示，则1mmol/L尿素=2mmol/L尿素氮。世界卫生组织推荐尿素用mmol/L表示，我国卫生部临检中心也已规定一律使用此表示方法，不再用尿素氮一词。实验七、氨基酸纸层析【原理】纸层析法是应用最广泛的一种分配层析。分配层析是利用混合物在二种或两种以上的不同溶剂中的分配系数不同，而使物质分离的方法。如用带水的载体作固定相，加入与水不相混合或仅部分混合的溶剂作为流动相，则混合物各组分在两相间发生不同的分配现象而遂渐分开，形成色层。纸层析法以滤纸为载体，滤纸上吸附着水（约含20%～22%）是经常用的固定相。某些有机溶剂为流动相，把欲分离的物质加在距圆心一定距离的同心圆上，使流动溶剂由中心向四周扩散，这样在两相之间发生分配现象。由于物质分配系数的不同，就逐渐在纸上集中于不同的部位。在固定相中分配趋势较大的成分，随流动相移动的速度就慢：反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度就快。物质在纸上移动的速度可以用Rf（移动速率）表示：色斑中心至原点中心的距离Rr=溶剂前缘至原点中心的距离在一定条件下，某种物质的R值是常数。【操作】1.取滤纸一张，直径要比培养皿稍大。用圆规自滤纸圆心处以1厘米为半径画圆，画圆时不可折叠滤纸，将此圆的圆周分成四等份，并作好标记。2．将滤纸平放在干净且干燥的培养血上，在画好的圆周四等份处，分别用干净的毛细管小心点样，样品直径不得超过0.5厘米，用吹风机吹干或在空气中自然干燥。3.取一长2厘米、宽一厘米的同一原料的滤纸条，将其一端剪成条状，卷起来即成纸芯。然后在滤纸的圆心处穿一小孔，空口大小恰好使纸芯插入，即不松，也不紧，然后剪去纸芯之上端尽量与纸面相齐，下端刚好接触底为宜。4.取下滤纸，将展开剂10毫升（血中央液深约2厘米），经玻璃棒慢慢倒入培养血中。再将小滤纸放置如前，并

[方法评估] 尿素氮测定的方法有好多种，如次溴酸钠法、尿素酶法及二乙酰一肟法等，但生化检验常用的为尿素酶法及二乙 酰一肟法。二乙酰一肟法试剂单一，方法简便，但试剂具毒性和腐蚀性，该方法易受标本混浊、黄疸、溶血等因素影 响，操作时应注意。 二乙酰一肟法的主要干扰来自血清中存在的含氮化合物。很多其它化合物在结构中会有尿素的残基，如瓜氨酸、 四氧嘧啶和尿囊素，虽然也会产生一种带颜色的产物，但这些化合物在血清中浓度很低，故很少引起明显的干扰。另 一些其它的化合物在血清中浓度高，但这些色素的最大吸收峰不同，因此不产生明显干扰。胆红素达 171μmol/L、血 红蛋白达 10g/L 均无影响。 [注意事项] 1、由于反应在强酸中进行，产生的羟胺是干扰物质，所以必须用氧化剂将其氧化除去。提高酸的浓度可以提高显 色反应的灵敏度。 2．试剂中加入氨基硫脲和镉离子，可增进显色强度和色泽稳定性，但仍有轻度褪色现象，(每小时小于 5%)。煮 沸显色经冷却后，应及时比色。 3、如血浆或血清尿素氮浓度超过 40mg/100ml 时，则必须将标本用生理盐水稀释后再操作，结果乘稀释倍数。 4．尿素浓度以前习惯用尿素氮 mg/dl 表示，因为一个尿素分子中有 2 个氮原子，所以 1mmol 尿素相当于 28mg 尿 素氮(1mmol/L 尿素相当于 2.8mg/dL 尿素氮)；另外还有以尿素氮 mmol/L 表示，则 1mmol/L 尿素＝2mmol/L 尿素氮。世 界卫生组织推荐尿素用 mmol/L 表示，我国卫生部临检中心也已规定一律使用此表示方法，不再用尿素氮一词。 实验七、 氨基酸纸层析 【原理】 纸层析法是应用最广泛的一种分配层析。分配层析是利用混合物在二种或两种以上的不同溶剂中的分配系数不同， 而使物质分离的方法。如用带水的载体作固定相，加入与水不相混合或仅部分混合的溶剂作为流动相，则混合物各组 分在两相间发生不同的分配现象而逐渐分开，形成色层。 纸层析法以滤纸为载体，滤纸上吸附着水（约含 20％～22％）是经常用的固定相。某些有机溶剂为流动相，把欲 分离的物质加在距圆心一定距离的同心圆上，使流动溶剂由中心向四周扩散，这样在两相之间发生分配现象。由于物 质分配系数的不同，就逐渐在纸上集中于不同的部位。在固定相中分配趋势较大的成分，随流动相移动的速度就慢； 反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度就快。物质在纸上移动的速度可以用 Rf（移动速率）表示： Rf＝ 色斑中心至原点中心的距离 溶剂前缘至原点中心的距离 在一定条件下，某种物质的 Rf 值是常数。 【操作】 1．取滤纸一张，直径要比培养皿稍大。用圆规自滤纸圆心处以 1 厘米为半径画圆，画圆时不可折叠滤纸，将此圆 的圆周分成四等份，并作好标记。 2．将滤纸平放在干净且干燥的培养皿上，在画好的圆周四等份处，分别用干净的毛细管小心点样，样品直径不得 超过 0.5 厘米，用吹风机吹干或在空气中自然干燥。 3．取一长 2 厘米、宽一厘米的同一原料的滤纸条，将其一端剪成条状，卷起来即成纸芯。然后在滤纸的圆心处穿 一小孔，空口大小恰好使纸芯插入，即不松，也不紧，然后剪去纸芯之上端尽量与纸面相齐，下端刚好接触底为宜。 4．取下滤纸，将展开剂 10 毫升（皿中央液深约 2 厘米），经玻璃棒慢慢倒入培养皿中。再将小滤纸放置如前，并

迅速用同样大小的培养血严密覆盖于上。（见图1）5．当溶剂展开至接近培养血边缘时，取出滤纸、拔出滤芯、迅速用铅笔划下展开剂前沿的位置，再用吹风机吹干或室温晾干。6.将上述滤纸平放于培养皿上，用喷雾器喷上0.1%三酮溶液，再用吹风机或60℃干燥箱干燥，此时可见紫色的色斑出现。用铅笔标记各色斑中心，测量并计算出各氨基酸的Rf值，比较Rf值，确定混合氨基酸的成分。培养皿图2滤纸层析示意图图1层析圆形滤纸【试剂】1.甘氨酸（丙氨酸）：甘（丙）氨酸20毫克，溶于5毫升蒸馏水中。2.亮氨酸：亮氨酸50毫克，溶于5毫升蒸馏水中，滴加6N盐酸促溶。3.酪氨酸：酪氨酸50毫克，溶于5毫升蒸馏水中，滴加6N盐酸促溶。4.氨基酸混合液：甘氨酸10毫克，酪氨酸15毫克，亮氨酸5毫克，共溶于1毫升蒸馏水中，加入6N盐酸1～3滴。5.0.1%节三酮乙醇溶液。6.展层剂：正丁醇：醋酸：水为4：1：5的体积比混合。混匀后，放置12小时，取上层液备用。实验八、血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳【实验目的】1.进一步掌握电泳的基本原理及凝胶电泳的原理。2.熟悉琼脂糖凝胶电泳的特点和操作要点。3.掌握正常人血浆脂蛋白的分类。【实验原理】琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖凝胶是由D-半乳糖和3，6脱水L-半乳糖的残基通过氢键交替排列组成的直链多糖。电泳时，因为凝胶中含水量大（98%～99%），固体支持物的影响较少，故电泳速度快、区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很小，是一种良好的电泳材料，分离效果较好。血清中脂类物质均与载脂蛋白结合成水溶性脂蛋白形式存在。蛋白质是两性电解质，它在电场中移动的方向受着所在溶液的pH影响。例如，血浆中的各种蛋白质，它们的等电点都在pH7.0以下，如将它们置于pH8.6的缓冲液中电泳时，它们都带负电，向正极移动。在同一pH溶液中，由于各种载脂蛋白所带电荷的性质和数量不同以及分子大小不同，因此它们在电场中的移动速度也有差别。因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分开

迅速用同样大小的培养皿严密覆盖于上。（见图 1） 5．当溶剂展开至接近培养皿边缘时，取出滤纸、拔出滤芯、迅速用铅笔划下展开剂前沿的位置，再用吹风机吹干 或室温晾干。 6．将上述滤纸平放于培养皿上，用喷雾器喷上 0.1％茚三酮溶液，再用吹风机或 60℃干燥箱干燥，此时可见紫色 的色斑出现。用铅笔标记各色斑中心，测量并计算出各氨基酸的 Rf 值，比较 Rf 值，确定混合氨基酸的成分。 图 2 滤纸层析示意图 图 1 层析圆形滤纸 【试剂】 1.甘氨酸（丙氨酸）：甘（丙）氨酸 20 毫克，溶于 5 毫升蒸馏水中。 2.亮氨酸：亮氨酸 50 毫克，溶于 5 毫升蒸馏水中，滴加 6N 盐酸促溶。 3.酪氨酸：酪氨酸 50 毫克，溶于 5 毫升蒸馏水中，滴加 6N 盐酸促溶。 4．氨基酸混合液：甘氨酸 10 毫克，酪氨酸 15 毫克，亮氨酸 5 毫克，共溶于 1 毫升蒸馏水中，加入 6N 盐酸 1～3 滴。 5．0.1％茚三酮乙醇溶液。 6．展层剂：正丁醇：醋酸：水为 4：1：5 的体积比混合。混匀后，放置 12 小时，取上层液备用。 实验八、血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳 【实验目的】 1.进一步掌握电泳的基本原理及凝胶电泳的原理。 2.熟悉琼脂糖凝胶电泳的特点和操作要点。 3.掌握正常人血浆脂蛋白的分类。 【实验原理】 琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖凝胶是由 D-半乳糖和 3，6 脱水 L-半乳糖的残基通过氢键交替排列组成的直链多 糖。电泳时，因为凝胶中含水量大（98%～99%），固体支持物的影响较少，故电泳速度快、区带整齐。而且由于琼脂糖 不含带电荷的基团，电渗影响很小，是一种良好的电泳材料，分离效果较好。 血清中脂类物质均与载脂蛋白结合成水溶性脂蛋白形式存在。蛋白质是两性电解质，它在电场中移动的方向受着 所在溶液的 pH 影响。例如，血浆中的各种蛋白质，它们的等电点都在 pH7.0 以下，如将它们置于 pH8.6 的缓冲液中电 泳时，它们都带负电，向正极移动。在同一 pH 溶液中，由于各种载脂蛋白所带电荷的性质和数量不同以及分子大小不 同，因此它们在电场中的移动速度也有差别。因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分开。 培养皿

琼脂糖凝胶电泳分离血清脂蛋白方法简单。将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑（或油红等）进行预染。再将预染过的血清置于琼脂糖凝胶板上进行分离。通电后，可以看到脂蛋白被分成三条区带，从负极到正极依次为β脂蛋白（最深）、前β脂蛋白（最浅）及α脂蛋白（比前β脂蛋白略深），在原点处应无乳糜微粒（血清脂蛋白用琼脂凝胶电泳只能分出两条区带：α一脂蛋白和β一脂蛋白）。此法应用于高脂蛋白血症的分型，可将血清脂蛋白分为几种不同的类型，为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病、高血压以及心肌梗死的临床诊断提供生化指标。【操作】1.予染血清：血清0.2ml加苏丹黑染色液0.02ml于小试管中混和后，置37℃水浴染色30分钟。然后离心（2000转/分）5分钟。2.制备琼脂糖凝胶板：已配制的0.35%琼脂糖凝胶（浓度可调）于沸水中加热融化。将凝胶溶液倾倒在制胶模具内，胶体的厚度34mm，注意不要产生气泡。静置约半小时后凝固（天热时需延长时间，亦可放冰箱数分钟加速凝固）。3，加样：将梳子轻轻拔出，用血色素吸管或微量注射器吸取经予染的血清约0.1毫升，注入凝胶板上的梳孔内。4.电泳：将加过血清的凝胶板平行放于电泳槽中，样品放于阴极一端，接通电源，电压为100120伏，约经电泳45～55分钟，即可见分离色带。【试剂】1.巴比妥缓冲液（pH8.6）：离子强度0.075（称取巴比妥钠15.4g，巴比妥2.76g，加水溶解后，再加蒸馏水定容至1000ml）作为电极缓冲液；配制琼脂糖凝胶者离子强度0.05（称取巴比妥钠10.3g，巴比妥1.82g，加水溶解后，再加蒸馏水定容至1000ml）。2.0.35%琼脂糖凝胶：称取琼脂糖0.35克，加入巴比妥缓冲液（离子强度0.05）100毫升，置沸水浴中溶解，分装于试管中，冰箱保存。3.染色液：苏丹黑0.1克溶于异丙醇10毫升中（或将苏丹黑B加到无水乙醇中至饱和，振荡使其乙基化，用前过滤）。实验九、动物组织中DNA的提取与鉴定【实验目的】1、掌握动物组织中DNA提取的原理和操作过程2、了解DNA的组分，掌握DNA的定性检测的具体方法【实验原理】动物组织细胞中的核糖核酸（RNA）与脱氧核糖核酸（DNA）大部分与蛋白质结合形成核蛋白.RNA核蛋白和DNA核蛋白在不同浓度氯化钠溶液中的溶解度有显著区别.DNA核蛋白在0.14mo1/L氯化钠中溶解度低，但在1-2mol/氯化钠中溶解度高RNA核蛋白在0.14mo1/L氯化钠中溶解度仍有相当大的溶解度.调节氯化钠浓度，可使RNA核蛋白和DNA核蛋白分步提取开来氯仿-异戊醇溶液可以使核蛋白变性沉淀，将核酸物质萃取出来：再向萃取液中加入适量乙醇，可使DNA析出.氯仿异戊醇抽提和乙醇沉淀方法在DNA纯化研究中非常常用，氯仿-异戊醇抽提的原理是，氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层；异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡.而DNA不溶于乙醇等有机溶剂，因此可以通过乙醇沉淀来纯化和浓缩DNA.（氯仿-异戊醇用苯酚、SDS替代DNA是由脱氧核糖核苷酸单体构成，其组成部分包括磷酸，有机碱（嘌呤与嘧啶），戊糖（脱氧核糖）1）磷酸钼酸铵、磷钼酸Vc或氨基萘酚磺酸、钼蓝（显蓝色）

琼脂糖凝胶电泳分离血清脂蛋白方法简单。将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑（或油红等）进行预染。再将预染过 的血清置于琼脂糖凝胶板上进行分离。通电后，可以看到脂蛋白被分成三条区带，从负极到正极依次为 β 脂蛋白（最 深）、前 β 脂蛋白（最浅）及 α 脂蛋白（比前 β 脂蛋白略深），在原点处应无乳糜微粒（血清脂蛋白用琼脂凝胶电泳 只能分出两条区带：α－脂蛋白和β－脂蛋白）。此法应用于高脂蛋白血症的分型，可将血清脂蛋白分为几种不同的类 型，为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病、高血压以及心肌梗死的临床诊断提供生化指标。 【操作】 1．予染血清：血清 0.2ml 加苏丹黑染色液 0.02ml 于小试管中混和后，置 37℃水浴染色 30 分钟。然后离心（2000 转/分）5 分钟。 2．制备琼脂糖凝胶板：已配制的 0.35％琼脂糖凝胶（浓度可调）于沸水中加热融化。将凝胶溶液倾倒在制胶模 具内，胶体的厚度 3~4mm，注意不要产生气泡。静置约半小时后凝固（天热时需延长时间，亦可放冰箱数分钟加速凝固）。 3．加样：将梳子轻轻拔出，用血色素吸管或微量注射器吸取经予染的血清约 0.1 毫升，注入凝胶板上的梳孔内。 4．电泳：将加过血清的凝胶板平行放于电泳槽中，样品放于阴极一端，接通电源，电压为 100～120 伏，约经电 泳 45～55 分钟，即可见分离色带。 【试剂】 1．巴比妥缓冲液（pH8.6）：离子强度 0.075（称取巴比妥钠 15.4g，巴比妥 2.76g，加水溶解后，再加蒸馏水定 容至 1000ml）作为电极缓冲液；配制琼脂糖凝胶者离子强度 0.05（称取巴比妥钠 10.3g，巴比妥 1.82g，加水溶解后， 再加蒸馏水定容至 1000ml）。 2．0.35％琼脂糖凝胶：称取琼脂糖 0.35 克，加入巴比妥缓冲液（离子强度 0.05）100 毫升，置沸水浴中溶解， 分装于试管中，冰箱保存。 3．染色液：苏丹黑 0.1 克溶于异丙醇 10 毫升中（或将苏丹黑 B 加到无水乙醇中至饱和，振荡使其乙基化，用前 过滤）。 实验九、动物组织中 DNA 的提取与鉴定 【实验目的】 1、掌握动物组织中 DNA 提取的原理和操作过程 2、了解 DNA 的组分,掌握 DNA 的定性检测的具体方法 【实验原理】 动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖核酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白.RNA 核蛋白和 DNA 核蛋白 在不同浓度氯化钠溶液中的溶解度有显著区别.DNA 核蛋白在 0.14 mol/L 氯化钠中溶解度低,但在 1 – 2 mol/L 氯化 钠中溶解度高;RNA 核蛋白在 0.14 mol/L 氯化钠中溶解度仍有相当大的溶解度.调节氯化钠浓度,可使 RNA 核蛋白和 DNA 核蛋白分步提取开来. 氯仿-异戊醇溶液可以使核蛋白变性沉淀,将核酸物质萃取出来;再向萃取液中加入适量乙醇,可使 DNA 析出.氯仿 异戊醇抽提和乙醇沉淀方法在DNA纯化研究中非常常用,氯仿-异戊醇抽提的原理是,氯仿可使蛋白质变性并加速有机相 与液相分层;异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡.而DNA不溶于乙醇等有机溶剂,因此可以通过乙醇沉淀来纯化和 浓缩 DNA.( 氯仿-异戊醇用苯酚、SDS 替代) DNA 是由脱氧核糖核苷酸单体构成,其组成部分包括磷酸,有机碱(嘌呤与嘧啶),戊糖(脱氧核糖). 1) 磷酸 钼酸铵 磷钼酸 Vc 或氨基萘酚磺酸 钼蓝 (显蓝色)

2）嘌呤碱硝酸银嘌呤银化合物（灰褐色，絮状）3）脱氧核糖硫酸→-羟基--酮基戊醛二苯胺蓝色化合物【实验试剂及仪器】含有0.14mo1/LNaC1的0.015mo1/L柠檬酸钠溶液、1mo1/LNaC1溶液、氯仿-异戊醇（24：1，V/V）、95%乙醇、5%（m/V)HzSO、10%氨水溶液、5%AgNO溶液、2.5%钼酸铵试剂（取蒸馏水400mL，加入浓硫酸83mL，将钼酸铵25g溶于其中，最后稀释至1L，冰箱放置一个月不变质）Vc-钼酸铵溶液（称取还原型抗坏血酸0.53g溶解于100mL2.5%钼酸铵溶液，贮于棕色瓶中，当天配制）二苯胺试剂（取1g纯的二苯胺溶于10mL重蒸馏的冰乙酸中，加入2.75mL浓硫酸，放置于棕色瓶，临用前新鲜配制）电子天平、匀浆器、电炉、离心机等【实验步骤】(一)DNA的提取1、取新鲜免肝组织3g，加入含有0.14mo1/LNaC1的0.015mo1/L柠檬酸钠溶液6mL在研钵中加入少量石英砂仔细研磨成匀浆，或用组织匀浆器匀浆30s；2、将匀浆倒入离心管，离心（4000rpm,15min），弃上清；3、沉淀中加入15mL1mo1/LNaC1，混匀，搅拌数分钟，离心（4000rpm,15min），弃沉淀；4、上清转移至另一离心管，加入等体积的氯仿-异戊醇（24：1，V/V）改为加入等体积的苯酚，剧烈振摇10min，离心（4000rpm,10min）;5、取上层，转移至另一离心管，加入等体积95%乙醇，可见白色丝状沉淀，可用玻棒慢慢缠绕取出沉淀，或离心（4000rpm，10min），取沉淀（DNA粗品），用1mL蒸馏水稀释溶解DNA(二)DNA的鉴定1、取部分DNA溶液加入试管，加4mL5%（m/V)HSO，再用带有长玻璃管的软木塞塞紧管口，在沸水浴中加热15min，静置数分钟水解DNA，取上清进行鉴定分析；2、取DNA水解液1mL,加二苯胺试剂2mL，摇匀于沸水浴中加热10min，观察颜色变化；3、取0.5mL5%AgNO.溶液，逐滴加入10%氨水，并使沉淀刚好溶解为宜，然后逐滴加入DNA水解液观察并记录现象；4、取0.5mLDNA水解液，加入Vc-钼酸铵溶液1mL，摇匀，放置10min，有何现象再将溶液加热，又发生什么变化，请解释。DNA提取及鉴定操作：(1）取3g肝脏加入6ml0.14mo1/L的NaC1溶液，在研钵中进行研磨，或在匀浆器中进行匀浆。2）用滴管从小烧杯里吸取6ml肝匀浆，放入带刻度的玻璃离心管中，离心（4000rpm，10min），弃上清。(3）向离心管的沉淀中加入3倍体积的1mol/LNaCl溶液，混匀，振荡10min，使DNA充分溶于1mo1/LNaCl溶液，离心（4000rpm，10min），弃沉淀。（4）往上清液中加入等体积的氯仿-异戊醇，混匀，振荡10min，离心（4000rpm，10min）。(5）将上清液移入离心管中，加入等体积的95%乙醇，混匀，振荡10min，使乙醇充分沉淀DNA，再离心（4000rpm，10min）弃上清。（6）向沉淀中加入2ml1mo1/LNaC1溶液，使沉淀充分溶解，再用二苯胺试剂进行鉴定

2) 嘌呤碱 硝酸银 嘌呤银化合物(灰褐色,絮状) 3) 脱氧核糖 硫酸 ω-羟基-γ-酮基戊醛 二苯胺 蓝色化合物 【实验试剂及仪器】 含有 0.14 mol/L NaCl 的 0.015 mol/L 柠檬酸钠溶液、1mol/L NaCl 溶液、氯仿-异戊醇(24 : 1, V/V)、95%乙醇、 5%(m/V)H2SO4、10%氨水溶液、5% AgNO3 溶液、 2.5%钼酸铵试剂 (取蒸馏水 400mL,加入浓硫酸 83 mL,将钼酸铵 25 g 溶于其中,最后稀释至 1 L,冰箱放置一个月不变质) Vc-钼酸铵溶液 (称取还原型抗坏血酸 0.53 g 溶解于 100 mL 2.5%钼酸铵溶液,贮于棕色瓶中,当天配制)二苯胺试剂(取 1 g 纯的二苯胺溶于 10 mL 重蒸馏的冰乙酸中,加入 2.75 mL 浓硫酸,放置于棕色瓶,临用前新鲜配制) 电子天平、匀浆器、电炉、离心机等 【实验步骤】 (一)DNA 的提取 1、取新鲜兔肝组织 3 g,加入含有 0.14 mol/L NaCl 的 0.015 mol/L 柠檬酸钠溶液 6 mL,在研钵中加入少量石英砂仔细 研磨成匀浆,或用组织匀浆器匀浆 30 s; 2、将匀浆倒入离心管,离心（4000 rpm,15 min）,弃上清; 3、沉淀中加入 15 mL 1mol/L NaCl,混匀,搅拌数分钟, 离心（4000 rpm,15 min）,弃沉淀; 4、上清转移至另一离心管,加入等体积的氯仿-异戊醇(24 : 1, V/V)改为加入等体积的苯酚,剧烈振摇 10 min, 离心 （4000 rpm,10 min）; 5、取上层,转移至另一离心管,加入等体积 95%乙醇,可见白色丝状沉淀,可用玻棒慢慢缠绕取出沉淀,或离心（4000 rpm,10 min），取沉淀(DNA 粗品),用 1 mL 蒸馏水稀释溶解 DNA. (二)DNA 的鉴定 1、取部分 DNA 溶液加入试管,加 4 mL5%(m/V)H2SO4,再用带有长玻璃管的软木塞塞紧管口,在沸水浴中加热 15 min,静置 数分钟水解 DNA,取上清进行鉴定分析; 2、取 DNA 水解液 1 mL,加二苯胺试剂 2 mL,摇匀于沸水浴中加热 10 min,观察颜色变化; 3、取 0.5 mL5% AgNO3 溶液,逐滴加入 10% 氨水,并使沉淀刚好溶解为宜,然后逐滴加入 DNA 水解液观察并记录现象; 4、取 0.5 mL DNA 水解液,加入 Vc-钼酸铵溶液 1 mL,摇匀,放置 10 min,有何现象 再将溶液加热,又发生什么变化,请解 释。 DNA 提取及鉴定操作： ⑴ 取 3g 肝脏加入 6ml 0.14mol/L 的 NaCl 溶液，在研钵中进行研磨，或在匀浆器中进行匀浆。 ⑵ 用滴管从小烧杯里吸取 6ml 肝匀浆，放入带刻度的玻璃离心管中，离心（4000rpm，10min），弃上清。 ⑶ 向离心管的沉淀中加入 3 倍体积的 1mol/L NaCl 溶液，混匀，振荡 10min，使 DNA 充分溶于 1mol/L NaCl 溶液，离 心（4000rpm，10min），弃沉淀。 ⑷ 往上清液中加入等体积的氯仿-异戊醇，混匀，振荡 10min，离心（4000rpm，10min）。 ⑸ 将上清液移入离心管中，加入等体积的 95%乙醇，混匀，振荡 10min，使乙醇充分沉淀 DNA，再离心（4000rpm，10min）， 弃上清。 ⑹ 向沉淀中加入 2ml 1mol/L NaCl 溶液，使沉淀充分溶解，再用二苯胺试剂进行鉴定