河南农业大学：《生物化学》课程教学资源（实验指导）实验三 酵母RNA的提制（浓盐法）

实验三酵母RNA的提制（浓盐法） 一、目的 学习和掌握从酵母中提制RNA的原理和方法，以加深对核酸性质的认识。 二、原理 酵母含RNA2.67%~10.0% ,DNA很少(0.03%~0.516%)，而且菌体容易收集，RNA 也易于分离，所以选用酵母为实验材料 RNA提制过程是先使NA从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去。再 根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，将pH调至2.0一2.5，使RNA沉淀，进行离心收 集。 提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法 。前者利用稀碱溶解细 胞 ,使RNA释放出米， 这种方法提取时间短，但RNA在此条件下不稳定， 容易分解 者在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的透性，使RNA释放出来，此法易掌握， 产品颜色较好。 三、仪器、试剂和材料 1.仪器 (1)量筒(50ml) (2)三角瓶(100ml) (3)烧杯(250ml,50ml,10ml) (4)布氏漏斗(40mm) (5)吸滤瓶(125ml） (6)表面皿(6cm (7)751型分光光度计 (8)离心机(4000r/min) (9)恒温水浴 (10)药物天平 (11)烘箱 2.试剂 (I)NaCI(化学纯) (2)6mol LHCI )95%乙醇（化学纯） 3.材料 鲜酵母或干酵母：pH0.5~5.0的精密试纸 四、操作步骤 1.提取 称取鲜酵母159或干酵母粉2.5g,倒入100ml三角瓶中，加NaC12.5g,水25ml,搅 拌均匀，置于沸水浴中提取h 2.分离 将上述提取液用自来水冷却后，装入大离心管内，以4000r/min离心10min,使提取 液与菌体残渣等分离

实验三 酵母 RNA 的提制（浓盐法） 一、目的 学习和掌握从酵母中提制 RNA 的原理和方法，以加深对核酸性质的认识。 二、原理 酵母含 RNA 2.67％～10.0％，DNA 很少（0.03％～0.516％），而且菌体容易收集，RNA 也易于分离，所以选用酵母为实验材料。 RNA 提制过程是先使 RNA 从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去。再 根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，将 pH 调至 2.0～2.5，使 RNA 沉淀，进行离心收 集。 提取 RNA 的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。前者利用稀碱溶解细 胞壁，使 RNA 释放出来，这种方法提取时间短，但 RNA 在此条件下不稳定，容易分解； 后者在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的透性，使 RNA 释放出来，此法易掌握， 产品颜色较好。 三、仪器、试剂和材料 1．仪器 （1）量筒（50ml） （2）三角瓶（100ml） （3）烧杯（250ml，50ml，10ml） （4）布氏漏斗（40mm） （5）吸滤瓶（125ml） （6）表面皿（6cm） （7）751 型分光光度计 （8）离心机（4000r／min） （9）恒温水浴 （10）药物天平 （11）烘箱 2．试剂 （l）NaCl（化学纯） （2）6mol／L HCI （3）95％乙醇（化学纯） 3．材料 鲜酵母或干酵母；pHO.5～5.0 的精密试纸。 四、操作步骤 1．提取 称取鲜酵母 159 或干酵母粉 2.5g，倒入 100ml 三角瓶中，加 NaCl 2.5g，水 25ml，搅 拌均匀，置于沸水浴中提取 lh。 2．分离 将上述提取液用自来水冷却后，装入大离心管内，以 4000r／min 离心 10min，使提取 液与菌体残渣等分离

3.沉淀RNA 将离心得到的上清液顿于50ml烧杯内，并置入放有冰块的250ml烧杯中冷却.待冷 至10℃以下时，用6mol/LHCI小心地调节pH值至20~2.5（注意严格控制pH)。调好 后继续于冰水中静置10min,使沉淀充分，颗粒变大. 4.洗涤和抽滤 上述悬浮液以400Or/min离心1Omin,得到RNA沉淀。将沉淀物放在10ml小烧 杯内，用95%的乙醇5一10ml充分搅拌洗涤，然后在布氏漏斗上用射水泵抽气过滤，再用 95 乙醇5 10ml淋洗3次 5.干燥 从布氏漏斗上取下沉淀物，放在6cm表面皿上，铺成薄层，置于80℃烘箱内干燥。将 干燥后的RNA制品称重，存放于干燥器内。 6.含量测定 干燥后RNA产品配制成浓度为 50pg ml的溶液，在751型分光光度 计上测定其260nm处的吸光度，按下式计算RNA含量： RNA含量(%)=O.2XL×R最积x10 五、结果处理 根据含量测定的结果按下式计算提取率 RA提取率(%)=山金量制晶重凤x10m 六、注意事项 1.用浓盐法提取RNA时应注意掌握温度，避免在20~27℃之间停留时间过长，因为 这是磷酸二酯酶和碳酸单酯酶作用活跃的温度范围，会使RNA降解而降低提取率。 2.加热至90~1O0C使蛋白质变性，破坏两类磷酸酯酶，有利于RNA的提取 七、思考题 1.沉淀RNA之前为什么要冷却上清液至I0C以下？ 2.为什么要将pH调至2.0~2.5？ 参考文献 文树基。主编基础生物化学实验指导.西安：陕西科学技术出版社，1994 西北农业大学主编基础生物化学实验指导。西安：陕西科学技术出版社，1986 袁玉苏，朱婉华，陈钧辉编生物化学实验北京：人民教育出版社，1979 朱检，曹凯鸣，周M庞，蔡武城，袁厚积编著.生物化学实验上海：上海科学技术出 版社，1981

3．沉淀 RNA 将离心得到的上清液倾于 50ml 烧杯内，并置入放有冰块的 250ml 烧杯中冷却．待冷 至 10℃以下时，用 6mol／L HCI 小心地调节 pH 值至 2.0～2.5（注意严格控制 pH）。调好 后继续于冰水中静置 10min，使沉淀充分，颗粒变大。 4．洗涤和抽滤 上述悬浮液以 4000r／min 离心 10min，得到 RNA 沉淀。将沉淀物放在 10ml 小烧 杯内，用 95％的乙醇 5～10ml 充分搅拌洗涤，然后在布氏漏斗上用射水泵抽气过滤，再用 95％乙醇 5～10ml 淋洗 3 次。 5．干燥 从布氏漏斗上取下沉淀物，放在 6cm 表面皿上，铺成薄层，置于 80℃烘箱内干燥。将 干燥后的 RNA 制品称重，存放于干燥器内。 6．含量测定 将干燥后 RNA 产品配制成浓度为 10—50pg／ml 的溶液，在 751 型分光光度 计上测定其 260nm 处的吸光度，按下式计算 RNA 含量： 式中，A260 为 260nm 处的吸光度；L 为比色杯光径（cm）；0.024 为 lml 溶液含 lμg RNA 的吸光度。 五、结果处理 根据含量测定的结果按下式计算提取率 六、注意事项 1．用浓盐法提取 RNA 时应注意掌握温度，避免在 20～27℃之间停留时间过长，因为 这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用活跃的温度范围，会使 RNA 降解而降低提取率。 2．加热至 90～100℃使蛋白质变性，破坏两类磷酸酯酶，有利于 RNA 的提取。 七、思考题 1．沉淀 RNA 之前为什么要冷却上清液至 10℃以下？ 2．为什么要将 pH 调至 2.0～2.5？ 参考文献 文树基。主编基础生物化学实验指导．西安：陕西科学技术出版社，1994 西北农业大学主编基础生物化学实验指导。西安：陕西科学技术出版社，1986 袁玉苏，朱婉华，陈钧辉编生物化学实验北京：人民教育出版社，1979 朱检，曹凯鸣，周 M 庞，蔡武城，袁厚积编著．生物化学实验上海：上海科学技术出 版社，1981