河南农业大学：《生物化学》课程教学资源（实验指导）实验九 酶的基本性质

实验九酶的基本性质 一、目的 酶是生物催化剂，是具有催化功能的蛋白质，生物体内的化学反应基本上都 是在酶催化下进行的。通过本实验了解酶催化的高效性、特异性以及pH、温度、 抑制剂和激活剂对酶活力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十 分重要的意义 二、原理 过氧化氢酶广泛分布于生物体内，能将代谢中产生的有害的H02分解成出O 和O,使H,0,不致在体内大量积多。其催化效率比无机催化剂铁粉高10个数量 级，反应速率可观察O2产生情况 酶与一般催化剂最主要的区别之一是酶具有高度的特异（专 )性，即一种 酶只能对一种或一类化合物起催化作用。例如，淀粉酶和蔗糖酶虽然都催化糖昔 健的水解，但是淀粉酶只对淀粉起作用，蔗糖酶只水解蔗糖。还原糖产物可用本 乃狄试剂鉴定。 通过比较淀粉酶在不同H、不同温度以及有无抑制剂或激活剂时水解淀粉的 差异，说明这些环 境因素与酶活性的关系 三、仪器、试剂和材料 1.仪器 (1)恒温水浴(37℃，70℃)、沸水浴(10℃)、冰浴(0℃) (2)试管18×180共19支 (3)吸管lm1支、2ml3支、5ml5支 (4)量筒100ml1个 (5)白瓷板 (6)胶头滴管3支 2.试剂 Fe粉 (2)2%H02(用时现配) (3)唾液淀粉酶溶液：先用蒸馏水漱口，再含10m左右蒸馏水，轻 轻漱动，数分钟后吐出收集在烧杯中，用数层纱布或棉花过滤，即得清彻 的唾液淀粉酶原液根据酶活高低稀释50~100倍，即为唾液淀粉酶溶液。 (4)蔗糖酶溶液：取1g鲜酵母或干酵母放入研体中，加入少量石英砂 和水研磨，加50ml蒸馏水，静置片刻，过滤即得。 (5)2%燕糖溶液：用分析纯蔗糖新鲜配制。 (6)1%淀粉溶液：1g淀粉和0,3 e NaCI,用5ml蒸馏水悬浮，慢慢 入60ml煮沸的蒸馏水中，煮沸min,冷却至室温，加水到100ml,冰箱贮 (7)0.1%淀粉溶液：0.1g淀粉，以5ml水悬浮，慢慢倒入60ml煮沸的 蒸偏水中，煮沸lmin,冷却至室温，加水到100ml,冰箱贮存。 (8)本乃狄(Benedict)试剂：17.3gCuS0,·5H0,加100ml蒸馏水 加热溶解，冷却：173g柠檬酸钠和100gNaC0,·2H0,以600ml蒸馏

实验九 酶的基本性质 一、目的 酶是生物催化剂，是具有催化功能的蛋白质，生物体内的化学反应基本上都 是在酶催化下进行的。通过本实验了解酶催化的高效性、特异性以及 pH、温度、 抑制剂和激活剂对酶活力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十 分重要的意义。 二、原理 过氧化氢酶广泛分布于生物体内，能将代谢中产生的有害的 H2O2 分解成 H2O 和 O2，使 H2O2 不致在体内大量积累。其催化效率比无机催化剂铁粉高 10 个数量 级，反应速率可观察 O2 产生情况。 酶与一般催化剂最主要的区别之一是酶具有高度的特异（专一）性，即一种 酶只能对一种或一类化合物起催化作用。例如，淀粉酶和蔗糖酶虽然都催化糖昔 键的水解，但是淀粉酶只对淀粉起作用，蔗糖酶只水解蔗糖。还原糖产物可用本 乃狄试剂鉴定。 通过比较淀粉酶在不同 pH、不同温度以及有无抑制剂或激活剂时水解淀粉的 差异，说明这些环境因素与酶活性的关系。 三、仪器、试剂和材料 1．仪器 （1）恒温水浴（37℃，70℃）、沸水浴（10℃）、冰浴（0℃） （2）试管 18 ×180 共 19 支 （3）吸管 lm l 支、2ml 3 支、5ml 5 支 （4）量筒 100ml 1 个 （5）白瓷板 （6）胶头滴管 3 支 2．试剂 （1） Fe 粉 （2） 2％H2O2（用时现配） （3） 唾液淀粉酶溶液：先用蒸馏水漱口，再含 10ml 左右蒸馏水，轻 轻漱动，数分钟后吐出收集在烧杯中，用数层纱布或棉花过滤，即得清彻 的唾液淀粉酶原液根据酶活高低稀释 50～100 倍，即为唾液淀粉酶溶液。 （4）蔗糖酶溶液：取 1g 鲜酵母或干酵母放入研钵中，加入少量石英砂 和水研磨，加 50ml 蒸馏水，静置片刻，过滤即得。 （5）2％蔗糖溶液：用分析纯蔗糖新鲜配制。 （6）1％淀粉溶液：1g 淀粉和 0.3g NaCI，用 5ml 蒸馏水悬浮，慢慢倒 入 60ml 煮沸的蒸馏水中，煮沸 lmin，冷却至室温，加水到 100ml，冰箱贮 存。 （7）0.1％淀粉溶液：0.1g 淀粉，以 5ml 水悬浮，慢慢倒入 60ml 煮沸的 蒸馏水中，煮沸 lmin，冷却至室温，加水到 100ml，冰箱贮存。 （8）本乃狄（Benedict）试剂：17.3g CuSO4·5H2O，加 100ml 蒸馏水 加热溶解，冷却；173g 柠檬酸钠和 100g NaCO3·2H2O，以 600ml 蒸馏

水加热溶解，冷却后将CSO4溶液慢慢加到柠檬酸钠碳酸钠溶液中，边加 边搅匀，最后定容至1000ml。如有沉淀可过滤除去，此试剂可长期保存。 (9)碘液： gKN溶于5ml蒸馏水中，加1g,溶解后再加295m1水， 混匀贮存于棕色瓶中 (10)磷酸缓冲液： A液：0.2mol/LNazHPO 称取28.40 gNazHPO.4(或71.64 gNacHPO4·12H0)溶于1000ml水中。 Ph5.0缓冲液：10.30mlA液十9.70mlB液 plH7.0缓冲液：16.47mlA液十3.53mlB液 Ph5.0缓冲液：19.45mlA液十0.55mlB液 (1)1%CuS04·5H.0溶液。 12)1%Na溶液。 3.材料 每组约0.5cm的马铃薯方块（生、熟）。 四、操作步骤 1.酶催化的高效性 取4支试管，按下表操作： 管号 操作项目 1 2 3 4 2%H02(ml 3 3 生马铃葵小块（块） 0 0 0 熟马铃薯小块（块） 0 2 0 0 铁粉 0 0 一小匙 0 现象 解释实验现象 2.酶催化的专一性 取6支干净试管，按下表操作： 管 号 操作项目 1 3 1%淀粉(ml) 1 0 0 1 2%爸糖(ml 0 0 1 0 唾液淀粉陈原液(ml 1 0 0 0 蔗糖酶溶液(ml 0 1 0 0 0 蒸馏水(ml 0 0 陈促水解 摇匀，37℃水浴中保温10mm 本乃狄试剂ml 各2ml

水加热溶解，冷却后将 CuSO4 溶液慢慢加到柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加 边搅匀，最后定容至 1000ml。如有沉淀可过滤除去，此试剂可长期保存。 （9）碘液：3g KI 溶于 5ml 蒸馏水中，加 1g I2，溶解后再加 295ml 水， 混匀贮存于棕色瓶中。 （10）磷酸缓冲液： A 液：0.2 mol／L Na2HPO4 称取 28.40g Na2HPO4（或 71.64g Na2HPO4·12H2O）溶于 1000ml 水中。 B 液：0.lmol／L 柠檬酸 称取 21.01g 柠檬酸（C6H8O7·H2O）溶于 1000ml 水中。 Ph5.0 缓冲液：10.30ml A 液十 9.70ml B 液 pH7.0 缓冲液：16.47ml A 液十 3.53ml B 液 Ph5.0 缓冲液：19.45ml A 液十 0.55ml B 液 （11）1％CuSO4·5H.O 溶液。 （12）1％NaCl 溶液。 3．材料 每组约 0.5 cm 的马铃薯方块（生、熟）。 四、操作步骤 1．酶催化的高效性 取 4 支试管，按下表操作： 操作项目 管 号 1 2 3 4 2％H202(ml) 3 3 3 3 生马铃薯小块（块） 2 0 0 0 熟马铃薯小块（块） 0 2 0 0 铁粉 0 0 一小匙 0 现象 解释实验现象 2．酶催化的专一性 取 6 支干净试管，按下表操作： 操作项目 管 号 1 2 3 4 5 6 1％淀粉(ml) 1 1 0 0 1 0 2％蔗糖(ml) 0 0 1 1 0 1 唾液淀粉酶原液(ml) 1 0 1 0 0 0 蔗糖酶溶液(ml) 0 1 0 1 0 0 蒸馏水(ml) 0 0 0 0 1 1 酶促水解 摇匀，37℃水浴中保温 10 min 本乃狄试剂(ml) 各 2 ml

反应 摇匀，沸水浴中加热5一10min 现象 解释实验现象 3。温度对酶活力的影响 取3支试管，按下表操作： 管号 操作项目 1 2 3 唾液淀粉酶溶液(ml PH7.0磷酸缓冲液(m 2 2 2 温度顶处理5mn 0℃37℃70℃ 1%淀粉溶液(ml) 2 22 摇匀，保持各自温度继续反应，数分钟后每隔半分钟从第2号管吸取1滴反 应液于白瓷板上，用碘液检查反应进行情况，直至反应液不再变色（只有碘液的 颜色)，立即取出所有试管，流水冷却5min,各加1滴碘液，混匀。观察并记录 各管反应现象，解释之。 4. H对酶活力的影响 取3支试管，按下表操作 管号 操作项目 3 PH5.0磷酸缓冲液(ml 0 H70猿酸缓冲液(m 0 0 1 PH8.0磷酸缓冲液(ml) 0 1 1%淀粉溶液(m 0 0 预保温 摇匀，37℃水浴中保温2mim 唾液淀粉酶溶液（m 据匀，置37℃水浴中攀续反应。每隔华分钟从第2号管 检查淀粉水解程度 中取出1滴反应液于白磁板上，如确液检查反应情况 直至反应液不科变色。即停止反应。取出所有管 确液（滴） 各1滴 现象 解释实脸现象

反应 摇匀，沸水浴中加热 5～10 min 现象 解释实验现象 3．温度对酶活力的影响 取 3 支试管，按下表操作： 操作项目 管 号 1 2 3 唾液淀粉酶溶液(ml) 1 1 1 PH7.0 磷酸缓冲液(ml) 2 2 2 温度预处理 5min 0℃ 37℃ 70℃ 1％淀粉溶液(ml) 2 2 2 摇匀，保持各自温度继续反应，数分钟后每隔半分钟从第 2 号管吸取 1 滴反 应液于白瓷板上，用碘液检查反应进行情况，直至反应液不再变色（只有碘液的 颜色），立即取出所有试管，流水冷却 5min，各加 1 滴碘液，混匀。观察并记录 各管反应现象，解释之。 4．pH 对酶活力的影响 取 3 支试管，按下表操作： 操作项目 管 号 1 2 3 PH5.0 磷酸缓冲液(ml) 1 1 0 pH7.0 磷酸缓冲液(ml) 0 0 1 PH8.0 磷酸缓冲液(ml) 1 0 1 1％淀粉溶液(ml) 0 1 0 预保温 摇匀，37℃水浴中保温 2 min 唾液淀粉酶溶液(ml) 检查淀粉水解程度 摇匀，置 37℃水浴中继续反应，每隔半分钟从第 2 号管 中取出 1 滴反应液于白磁板上，加碘液检查反应情况， 直至反应液不再变色，即停止反应，取出所有管。 碘液（滴） 各 1 滴 现象 解释实验现象

5.抑制剂和激活剂 管 号 操作项目 3 1%NaCI(ml) 1 0 0 1%CuSO(ml) 0 0 蒸馏水 0 0 睡液淀粉酶溶液(ml 1%淀粉溶液(ml 3 3 3 检查淀粉水解程度 据匀，置37℃水浴中1mn左右即可用碘液检查1号管淀粉的 水解程度。待1号管反应液不再变色，即停止反吨，取出所有管。 确液（滴） 各1滴 现象 解释实验现象 五、注意事项 (1)各人唾液中淀粉酶活力不同，因此实验3、4、5应随时检查反应进行情 况。如反应 行太快 应适当稀释唾液 反之 定粉酶稀释倍数 (2)酶的抑制与激活最好用经透析的睡液，因为唾液中含有少量C。另外 注意不要在检查反应程度时使各管溶液混杂。 六、思考题 、温度和pH对酶促反应速度的影响。 3,酶作为一种生物催化剂，有那些催化特点？ 参考文献 文树基.基础生物化学实验指导.西安：陕西科学技术出版社，1994 西北农业大学主编基础生物化学实验指导.西安：陕西科学技术出版社，1986

5．抑制剂和激活剂 操作项目 管 号 1 2 3 1％NaCl(ml) 1 0 0 1%CuSO4(ml) 0 1 0 蒸馏水(ml) 0 0 1 唾液淀粉酶溶液(ml) 1 1 1 1％淀粉溶液(ml) 3 3 3 检查淀粉水解程度 摇匀，置 37℃水浴中 1min 左右即可用碘液检查 1 号管淀粉的 水解程度。待 1 号管反应液不再变色，即停止反应，取出所有管。 碘液（滴） 各 1 滴 现象 解释实验现象 五、注意事项 （1）各人唾液中淀粉酶活力不同，因此实验 3、4、5 应随时检查反应进行情 况。如反应进行太快，应适当稀释唾液；反之，则应减少唾液淀粉酶稀释倍数。 （2）酶的抑制与激活最好用经透析的唾液，因为唾液中含有少量 Cl－。另外， 注意不要在检查反应程度时使各管溶液混杂。 六、思考题 1．何谓酶的最适 PH 和最适温度？ 2．说明底物浓度、酶浓度、温度和 pH 对酶促反应速度的影响。 3．酶作为一种生物催化剂，有那些催化特点？ 参考文献 文树基. 基础生物化学实验指导. 西安：陕西科学技术出版社，1994 西北农业大学主编基础生物化学实验指导. 西安：陕西科学技术出版社，1986