河南农业大学：《生物化学》课程教学资源（实验指导）实验二 菜花（花椰莱）中核酸的分离和鉴定

实验二菜花（花椰莱）中核酸的分离和鉴定 一、目的 初步掌握从菜花中分离核酸的方法，和RNA、DNA的定性检定。 二、原理 用冰冷的稀三氯乙酸或稀高氯酸溶液在低温下抽提菜花匀浆，以除去酸溶性 小分子等物质。再用有机溶剂，如乙醇、乙醇等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物质。 最后用浓盐溶液(10%氯化钠溶液)和0.5摩尔/升高氯酸(70℃)分别提取DNA 和RNA,再进行定性检定。 由于核糖和脱氧核糖有特殊的颜色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一定 范围内和样品中所含的核糖和脱氧核糖的量成正比，因此可用定糖法来定性定量 测定核酸。 l.核糖的测定：测定核糖的常用方法是苔黑酚（即3,5-二羟甲苯）法(Oreinol 反应)。当含有核糖的RNA与浓盐酸及3,5-二羟甲苯在沸水浴中加热1(10一20分 钟后，有绿色物产生，这是因为RNA脱瞟吟后的核糖与酸作用生成糠醛，后者再 与3,5二羟甲苯作用产生绿色物质。 CH, RNA十浓盐酸十HG 100C绿色复合物 -OH FeCLa DNA、蛋白质和粘多糖等物质对测定有干扰作用。 2,脱氧核糖的测定：测定脱氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脱氧核糖的 DNA在酸性条件下和二苯胺在沸水浴中共热I0分钟后，产生蓝色。这是因为DNA 嘌吟核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成。羟基6-酮基成醛，它再和二苯胺作用产生蓝 色物质。 DNA+少量浓H,SO, 100C蓝色物 此法易受多种糖类及其衍生物和蛋白质的干扰。 上述两种定糖的方法准确性较差，但快速简便，能鉴别DNA与RNA,是检 定核酸、核昔酸的常用方法。 三、器材 1.恒温水浴 2.电炉。 3.离心机。 4.布氏漏斗装置。 5.吸管。 6.烧杯

实验二 菜花（花椰莱）中核酸的分离和鉴定 一、目 的 初步掌握从菜花中分离核酸的方法，和 RNA、DNA 的定性检定。 二、原 理 用冰冷的稀三氯乙酸或稀高氯酸溶液在低温下抽提菜花匀浆，以除去酸溶性 小分子等物质。再用有机溶剂，如乙醇、乙醇等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物质。 最后用浓盐溶液（10％氯化钠溶液）和 0.5 摩尔／升高氯酸（70℃）分别提取 DNA 和 RNA，再进行定性检定。 由于核糖和脱氧核糖有特殊的颜色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一定 范围内和样品中所含的核糖和脱氧核糖的量成正比，因此可用定糖法来定性定量 测定核酸。 1． 核糖的测定：测定核糖的常用方法是苔黑酚（即 3,5-二羟甲苯）法（Oreinol 反应）。当含有核糖的 RNA 与浓盐酸及 3,5-二羟甲苯在沸水浴中加热 l（10－20 分 钟后，有绿色物产生，这是因为 RNA 脱瞟吟后的核糖与酸作用生成糠醛，后者再 与 3,5-二羟甲苯作用产生绿色物质。 DNA、蛋白质和粘多糖等物质对测定有干扰作用。 2．脱氧核糖的测定：测定脱氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脱氧核糖的 DNA 在酸性条件下和二苯胺在沸水浴中共热 10 分钟后，产生蓝色。这是因为 DNA 嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-6-酮基戍醛，它再和二苯胺作用产生蓝 色物质。 此法易受多种糖类及其衍生物和蛋白质的干扰。 上述两种定糖的方法准确性较差，但快速简便，能鉴别 DNA 与 RNA，是检 定核酸、核昔酸的常用方法。 三、器 材 l．恒温水浴。 2．电炉。 3．离心机。 4．布氏漏斗装置。 5．吸管。 6．烧杯

7.量筒。 8.剪刀。 四、试剂和材料 1,新鲜菜花。 2.95%乙醇 600毫升 3.丙酮 400亲升 4.5%高氯酸溶液 5.0.5摩尔/升高氯酸溶液 6.10%氯化钠溶液 400毫升 7.标准RNA溶液(5毫克/100毫升)50毫升 8.标准DNA溶液(15毫克/100毫升)50毫升 9.二苯胺试剂 将1克 苯胺溶于100毫升冰醋酸中，再加人2.75毫升浓硫酸（置冰箱 中可保存6个月。使用前，在室温下摇匀)。 10.三氯化铁浓盐酸溶液 将2毫升10%三氯化铁溶液（用FεC,·6H0配制）加人到400毫升浓 盐酸中。 11。苔里了应溶湾 溶解6克苔黑酚于100毫升95%乙醇中（可在冰箱中保存1个月） 五、操作步骤： 1核酸的分离 (1)取莱花的花冠20克，剪碎后置于研体中。加人20毫升95%乙醇和400 毫克海沙，研磨成匀浆。然后用布氏漏 抽滤，并去滤液 (2)滤渣中加人20毫升丙酮，搅拌均匀，抽滤，弃去滤液。 (3)再向滤渣中加人20毫升丙酮，搅拌5分钟后抽干（于力压滤渣，尽量 除去丙酮)。 (4)在冰浴中，将滤渣悬浮在预冷的20毫升5%高氨酸溶液中。搅拌，抽滤 弃去滤液。 (5)将滤渣悬浮于20毫升95%乙醇中，抽滤，弃去滤液。 (6)滤渣中加人20毫升丙酮，搅拌5分钟。抽滤至干，用力压滤渣尽量除 去丙团。 (7)将干燥的滤渣重新悬浮在40毫升10%氯化钠溶液中。在沸水浴中加热 15分钟。放置，冷却，抽滤至干，留滤液。并将此操作重复进行一次。将两次 滤波合并，为提取物一。 (8)将滤渣重新悬浮在20毫升0.5摩尔/升高氨酸溶液中。加热到70”C。 保温20分钟（恒温水浴）后抽滤。留滤液（提取物二）。 2.RNA,DNA的定性鉴定： (1)二苯胺反应：

7．量筒。 8．剪刀。 四、试剂和材料 1．新鲜菜花。 2．95％乙醇 600 毫升 3．丙酮 400 毫升 4．5％高氯酸溶液 200 毫升 5．0.5 摩尔／升高氯酸溶液 200 毫升 6．10％氯化钠溶液 400 毫升 7．标准 RNA 溶液（5 毫克／100 毫升） 50 毫升 8．标准 DNA 溶液（15 毫克／100 毫升） 50 毫升 9．二苯胺试剂 将 1 克二苯胺溶于 l00 毫升冰醋酸中，再加人 2.75 毫升浓硫酸（置冰箱 中可保存 6 个月。使用前，在室温下摇匀）。 10．三氯化铁浓盐酸溶液 将 2 毫升 10％三氯化铁溶液（用 FeCl3·6H2O 配制）加人到 400 毫升浓 盐酸中。 11．苔黑酚乙醇溶液 溶解 6 克苔黑酚于 100 毫升 95％乙醇中（可在冰箱中保存 1 个月） 五、操作步骤： 1．核酸的分离 （1）取莱花的花冠 20 克，剪碎后置于研体中。加人 20 毫升 95％乙醇和 400 毫克海沙，研磨成匀浆。然后用布氏漏斗抽滤，并去滤液。 （2）滤渣中加人 20 毫升丙酮，搅拌均匀，抽滤，弃去滤液。 （3）再向滤渣中加人 20 毫升丙酮，搅拌 5 分钟后抽干（于力压滤渣，尽量 除去丙酮）。 （4）在冰浴中，将滤渣悬浮在预冷的 20 毫升 5％高氨酸溶液中。搅拌，抽滤， 弃去滤液。 （5）将滤渣悬浮于 20 毫升 95％乙醇中，抽滤，弃去滤液。 （6）滤渣中加人 20 毫升丙酮，搅拌 5 分钟。抽滤至干，用力压滤渣尽量除 去丙团。 （7）将干燥的滤渣重新悬浮在 40 毫升 10％氯化钠溶液中。在沸水浴中加热 15 分钟。放置，冷却，抽滤至干，留滤液。并将此操作重复进行一次。将两次 滤波合并，为提取物一。 （8）将滤渣重新悬浮在 20 毫升 0．5 摩尔／升高氨酸溶液中。加热到 70”C。 保温 20 分钟（恒温水浴）后抽滤。留滤液（提取物二）。 2．RNA, DNA 的定性鉴定： （1） 二苯胺反应：

管 号」 操作项目 1 2 3 4 蒸馏水(m 0 0 0 0 DNA溶液(ml 0 RNA溶液(md 0 0 0 0 提取物一《m) 0 0 0 0 提取物二(ml) 一荟胺试剂mn 2 2 2 2 2 沸水浴中加热10mim 后观察现象 (2)苔酚反应 管 号 操作项目 4 蒸馏水(ml 1 0 0 0 0 DNA溶液(ml) 0 0 0 0 RNA溶液(ml 0 0 提取物一ml) 0 0 0 0 提取物二(ml 0 0 0 0 三氯化铁ml 苔黑酚溶液(ml 各02 沸水浴中加热510m 后观察现象的现象 问题讨论： 根据现象分析提取物一和提取物二主要含有什么物质？

操作项目 管 号 1 2 3 4 5 蒸馏水(ml) 1 0 0 0 0 DNA 溶液(ml) 0 1 0 0 0 RNA 溶液(ml) 0 0 1 0 0 提取物一(ml) 0 0 0 1 0 提取物二(ml) 0 0 0 0 1 二苯胺试剂(ml) 2 2 2 2 2 沸水浴中加热 10 min 后观察现象 （2）苔酚反应 操作项目 管 号 1 2 3 4 5 蒸馏水(ml) 1 0 0 0 0 DNA 溶液(ml) 0 1 0 0 0 RNA 溶液(ml) 0 0 1 0 0 提取物一(ml) 0 0 0 1 0 提取物二(ml) 0 0 0 0 1 三氯化铁(ml) 2 2 2 2 2 苔黑酚溶液(ml) 各 0.2 沸水浴中加热 5-10 min 后观察现象的现象 问题讨论： 根据现象分析提取物一和提取物二主要含有什么物质？