河南农业大学：《生物化学》课程教学资源（实验指导）实验十三 蛋白质的两性性质及等电点的测定

实验十三蛋白质的两性性质及等电点的测定 一、目的 通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。掌捉通 过聚沉测定蛋白质等电点的方法。 二、原理 蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除N端α-氨基与C端 羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、腻基、咪唑基 等基团，它们都能解离为带电基团。因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡： COOH NH2 蛋白质分子 c- COOH H +0H NH +OH P NH 阴离子 两性离子 阳离子 pH>pl pH=pI pH<P 电场中：移向阳极 不移动 移向阴极 调节溶液的出使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相 等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质溶 解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同H的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液 中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。 三、仪器和试剂 1.仪器 (1)试管架 (2)试管：15ml×6 (3)刻度吸管：lml×4,2ml×4,10ml×2 (4)胶头吸管× 2.试剂 (1)1m0l/L乙酸 (2)0.1mol/L乙酸 (3)0.01mol/L乙酸 (4)0.2mol/LNaOH (5)0.2mol/L盐酸 (6)0.01%溴甲酚兰绿指示剂 (7)0.5%酪蛋白

实验十三 蛋白质的两性性质及等电点的测定 一、目的 通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。掌握通 过聚沉测定蛋白质等电点的方法。 二、原理 蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除 N-端α-氨基与 C-端α -羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、胍基、咪唑基 等基团，它们都能解离为带电基团。因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡： 调节溶液的 pH 使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相 等，净电荷为零，此时溶液的 pH 值称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质溶 解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同 pH 的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液 中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。 三、仪器和试剂 1．仪器 （1）试管架 （2）试管：15ml × 6 （3）刻度吸管：lml×4，2mI×4，10ml×2 （4）胶头吸管×2 2. 试剂 （1）1 mol／L 乙酸 （2）0.1 mol／L 乙酸 （3）0.01 mol／L 乙酸 （4）0.2 mol／L NaOH （5）0.2 mol／L 盐酸 （6）0.01％ 溴甲酚兰绿指示剂 （7）0.5％酪蛋白

四、操作步骤 (1)取一支试管，加0.5%酪蛋白1ml,再加溴甲酚兰绿指示剂4滴，摇匀 此时溶液呈蓝色，无沉淀形成。 (2)用胶头滴管慢慢加入0.2mol/L盐酸，边加便边摇直到有大量的沉淀生 成。此时溶液是pH值接近酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。 (3) 继续滴加0.2ml/L盐酸，沉淀会逐渐减少以至消失。观察此时溶液的 颜色变化 (4) 滴加0.2mol/L NaOH进行中和，沉淀又出现。继续滴加沉淀又逐渐消 失。观察此时溶液的颜色变化。 2.酪蛋白等电点的测定 (1)取同样规格的试管7支，按下表精确地加入下列试剂 试剂(ml) 1 2 3 4567 1mal/L乙酸 1.8 0 0 0 0 0.1mol/L乙酸 0 0 4.01.0000 0.01mol/L乙酸 0 0 2.5 1.250.62 HO 2.43.20 3.00.52.753.38 溶液的pH3.53.841 L47 535.659 (2)充分摇匀，然后向以上各试管依次加入0.5%酪蛋白1ml,边加边摇，摇匀后 静置5min,观察各管的混浊度。 五、结果处理 用一、十、十十、十十十等符号表示各管的混浊度。根据混浊度判断酪蛋白 的等电点。最混浊的一管的H值即为酪蛋白的等电点。 六、注意事项 缓冲液的pH值必须准确 七、思考题 1.解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。 2.该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？ 参考文献 宋治军，纪重光主编现代分析仪器与测试方法。西安：西北大学出版社，1995 文树基，主编基础生物化学实验指导。西安：陕西科学技术出版社，1994 西北农业大学主编基础生物化学实验指导。西安：陕西科学技术出版社，198 张龙翔主编生化实验方法和技术。北京：人民教育出版社，1982

四、操作步骤 （1） 取一支试管，加 0.5％酪蛋白 1ml，再加溴甲酚兰绿指示剂 4 滴，摇匀。 此时溶液呈蓝色，无沉淀形成。 （2） 用胶头滴管慢慢加入 0.2 mol／L 盐酸，边加便边摇直到有大量的沉淀生 成。此时溶液是 pH 值接近酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。 （3） 继续滴加 0.2 mol／L 盐酸，沉淀会逐渐减少以至消失。观察此时溶液的 颜色变化。 （4） 滴加 0.2 mol／L NaOH 进行中和，沉淀又出现。继续滴加沉淀又逐渐消 失。观察此时溶液的颜色变化。 2. 酪蛋白等电点的测定 （1） 取同样规格的试管 7 支，按下表精确地加入下列试剂 试剂（ml） 管 号 1 2 3 4 5 6 7 1 mol／L 乙酸 1.8 0.8 0 0 0 0 0 0.1 mol／L 乙酸 0 0 4.0 1.0 0 0 0 0.01 mol／L 乙酸 0 0 0 0 2.5 1.25 0.62 H2O 2.4 3.2 0 3.0 0.5 2.75 3.38 溶液的 pH 3.5 3.8 4.1 4.7 5.3 5.6 5.9 （2）充分摇匀，然后向以上各试管依次加入 0.5％酪蛋白 l ml，边加边摇，摇匀后 静置 5min，观察各管的混浊度。 五、结果处理 用一、＋、＋＋、＋＋＋等符号表示各管的混浊度。根据混浊度判断酪蛋白 的等电点。最混浊的一管的 pH 值即为酪蛋白的等电点。 六、注意事项 缓冲液的 pH 值必须准确。 七、思考题 1．解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。 2．该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？ 参考文献 宋治军，纪重光主编现代分析仪器与测试方法。西安：西北大学出版社，1995 文树基，主编基础生物化学实验指导。西安：陕西科学技术出版社，1994 西北农业大学主编基础生物化学实验指导。西安：陕西科学技术出版社，1986 张龙翔主编生化实验方法和技术。北京：人民教育出版社，1982