河南农业大学：《生物化学》课程教学资源（实验指导）实验十四 还原糖和总糖含量的测定

实验十四还原糖和总糖含量的测定 (3,5二硝基水杨酸比色法) 一、目的 植物体内的还原糖，主要是萄萄糖、果糖和麦芽糖。它们在植物休内的分布 不仅反映植物体内碳水化合物的运转情况，而且也是呼吸作用的基质。 能形成其他物质如有机酸等：此外， 、蔬菜中含糖量的多 质的重要指标。还原糖在有机体的代谢中起着重要的作用，其他碳水化合物，如 淀粉、蔗糖等，经水解也生成还原糖。通过本实验，掌握还原糖定量测定的基本 原理，学习比色定糖法的基本操作，熟悉分光光度计的使用方法。 二、原理 各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用溶解度不同，可 将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使没有还原性的 双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。 基5硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及 物。在一定节 内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，在54O加m波书 下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖 和总糖的含量。 三、仪器、试剂和材料 1.仪器 (1)刻度试管：25ml (2)离心管或玻璃漏斗2个 (3)烧杯：100ml1个 (4)三角瓶：100ml1个 (5)容量瓶：100ml3个 (6)刻度吸管：1ml1个，2ml4个，10ml1个 (7)恒温水浴 (8)沸水浴 (9)离心机（过滤法不用此设备） (10)由子天平 (11)分光光度计 2.试剂 (1)lmg/ml葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80℃ 烘至恒重)，置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml的容量瓶中， 以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。 )3,5-二硝基水杨酸试剂：将6,3g3,5-二硝基水杨酸和262ml2mol NaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚利 5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定客至1000ml,贮于棕色瓶中备用。 (3)碘一碘化钾溶液：称取sg碘和109碘化钾，溶于100ml蒸馏水中

实验十四 还原糖和总糖含量的测定 （3,5-二硝基水杨酸比色法） 一、目的 植物体内的还原糖，主要是葡萄糖、果糖和麦芽糖。它们在植物体内的分布， 不仅反映植物体内碳水化合物的运转情况，而且也是呼吸作用的基质。还原糖还 能形成其他物质如有机酸等；此外，水果、蔬菜中含糖量的多少，也是鉴定其品 质的重要指标。还原糖在有机体的代谢中起着重要的作用，其他碳水化合物，如 淀粉、蔗糖等，经水解也生成还原糖。通过本实验，掌握还原糖定量测定的基本 原理，学习比色定糖法的基本操作，熟悉分光光度计的使用方法。 二、原理 各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用溶解度不同，可 将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使没有还原性的 双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。 在碱性条件下，还原糖与 3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为 3-氨 基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。在一定范围 内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，在 540nm 波长 下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖 和总糖的含量。 三、仪器、试剂和材料 1．仪器 （1）刻度试管：25ml （2）离心管或玻璃漏斗 2 个 （3）烧杯： 100ml 1 个 （4）三角瓶： 100ml 1 个 （5）容量瓶：100ml 3 个 （6）刻度吸管：lml 1 个，2ml 4 个，10mI 1 个 （7）恒温水浴 （8）沸水浴 （9）离心机（过滤法不用此设备） （10）电子天平 （11）分光光度计 2．试剂 （1）lmg／ml 葡萄糖标准液：准确称取 100mg 分析纯葡萄糖（预先在 80℃ 烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到 100ml 的容量瓶中， 以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。 （2）3,5-二硝基水杨酸试剂：将 6.3g 3,5-二硝基水杨酸和 262ml 2mol／L NaOH 溶液，加到 500ml 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定客至 1000ml，贮于棕色瓶中备用。 （3）碘一碘化钾溶液：称取 sg 碘和 109 碘化钾，溶于 100ml 蒸馏水中

(4)酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250ml70%乙醇中 (5)6mol /LHCI (6)6mol /LNaOH 3.材料 食用面粉。 四、操作步骤 1.制作葡萄糖标准曲线 取7支25ml刻度试管，编号，按下表操作。 管号 操作项目 3 4 萄萄糖标准液(m 0020406081012 蒸馆水(ml 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 3,5二硝基水扬酸ml 各15 将各管摇匀，在沸水浴中加热5mi,取出后立即冷却至室温，再以蒸馏水定 容至25ml,混匀。在540m波长下，用0号管调零，分别读取1~6号管的吸光 度。以吸光度为纵坐标， 葡萄糖毫克数为横坐标 绘制标准曲线， 2.样品中还原糖和总精含量的测定 (1)样品中还原糖的提取：准确称取3g食用面粉，放在100ml三角瓶中， 先以少量蒸馏水调成糊状，然后加50ml蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保 温20min,使还原谢浸出。离心或过滤，用20ml蒸馏水洗残渣，再离心或过滤 将两次离心的上清液或滤液全部收集在100ml的容量瓶中，用燕馏水定容至刻度， 混匀，作为还原糖待测液 (2)样品中总糖的水解和提取：准确称取1g食用面粉，放在100ml的三角 瓶中，加入10ml6mol/LHCI及15ml蒸馏水，置于沸水浴中加热水解30min。 取1一2滴水解液于白瓷板上，加1滴碘一碘化钾溶液，检查水解是否完全。如已 水解完全，则不显蓝色。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，以 6mol/LN0H中和至微红色，过滤，再用少 量蒸馏水冲洗三角瓶及滤纸，将滤液 全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀。精确吸取10ml定容 过的水解液，移入另一100ml的容量瓶中，以水稀释定容，混匀，作为总糖待测 液。 (3)显色和比色，取4支25ml刻度试管，编号，按下表所示的量操作。 还原糖测定管号 号 总糖测定管号 (1) (2) 11 还原糖待测液(ml) 0 葡萄糖标准液(m) 0 1 蒸馏水(ml 0 0 11 3,5.二硝基水扬酸ml 1.5 1.5 151.5 其余操作均与制作葡萄糖标准曲线时相同。 五、结果处理

（4）酚酞指示剂：称取 0.1g 酚酞，溶于 250ml 70％乙醇中。 （5）6mol／L HCl。 （6）6mol／L NaOH。 3．材料 食用面粉。 四、操作步骤 1．制作葡萄糖标准曲线 取 7 支 25ml 刻度试管，编号，按下表操作。 操作项目 管 号 0 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 蒸馏水(ml) 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 3,5-二硝基水扬酸(ml) 各 1.5 将各管摇匀，在沸水浴中加热 5min，取出后立即冷却至室温，再以蒸馏水定 容至 25ml，混匀。在 540nm 波长下，用 0 号管调零，分别读取 1～6 号管的吸光 度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。 2．样品中还原糖和总精含量的测定 （1）样品中还原糖的提取：准确称取 3g 食用面粉，放在 100ml 三角瓶中， 先以少量蒸馏水调成糊状，然后加 50ml 蒸馏水，搅匀，置于 50℃恒温水浴中保 温 20min，使还原糖浸出。离心或过滤，用 20ml 蒸馏水洗残渣，再离心或过滤， 将两次离心的上清液或滤液全部收集在 100ml 的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度， 混匀，作为还原糖待测液。 （2）样品中总糖的水解和提取：准确称取 1g 食用面粉，放在 100ml 的三角 瓶中，加入 10ml 6mol／L HCI 及 15ml 蒸馏水，置于沸水浴中加热水解 30min。 取 1—2 滴水解液于白瓷板上，加 1 滴碘一碘化钾溶液，检查水解是否完全。如已 水解完全，则不显蓝色。待三角瓶中的水解液冷却后，加入 1 滴酚酞指示剂，以 6mol／L NaOH 中和至微红色，过滤，再用少量蒸馏水冲洗三角瓶及滤纸，将滤液 全部收集在 100ml 的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀。精确吸取 10ml 定容 过的水解液，移入另一 100ml 的容量瓶中，以水稀释定容，混匀，作为总糖待测 液。 （3）显色和比色，取 4 支 25ml 刻度试管，编号，按下表所示的量操作。 管 号 还原糖测定管号 总糖测定管号 （1） （2） I II 还原糖待测液（ml） 1 1 0 0 葡萄糖标准液(ml) 0 0 1 1 蒸馏水(ml) 0 0 1 1 3,5-二硝基水扬酸(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 其余操作均与制作葡萄糖标准曲线时相同。 五、结果处理

以管①、②的吸光度平均值和管1、Ⅱ的吸光度平均值，分别在标准曲线上 查出相应的还原糖毫克数。按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。 还原糖% (查曲线所得到还原糖质量mg×(提取液总体积/测定时取用体 积)样品质量×10 总糖%=（查曲线所得到水解后还原糖质量mg×稀释倍数）/样品质量×100% 六、注意事项 标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色 七、思考题 1.可用不同材料，以比较含糖量的差异 参考文献 西北农业大学基础生物化学实验指导西安：陕西科学技术出版社，1986

以管①、②的吸光度平均值和管 I、II 的吸光度平均值，分别在标准曲线上 查出相应的还原糖毫克数。按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。 还原糖％＝（查曲线所得到还原糖质量 mg×（提取液总体积/测定时取用体 积））/样品质量×100 总糖％＝（查曲线所得到水解后还原糖质量 mg×稀释倍数）/样品质量×100% 六、注意事项 标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。 七、思考题 1．可用不同材料，以比较含糖量的差异。 2．面粉中主要含有何种糖？ 3．在提取糖时，其他杂质是否会影响到测定？ 参考文献 西北农业大学基础生物化学实验指导西安：陕西科学技术出版社，1986