河南农业大学：《生物化学》课程教学资源（实验指导）实验十一 蛋白质脱盐

实验十一蛋白质脱盐 (透析和凝胶过滤) 在蛋白质的研究中，经常要进行蛋白质脱盐，即将蛋白质同其它盐类小分子分离开。蛋 白质脱盐的方法很多，各有优缺点。以下仅介绍常用的透析和凝胶过滤方法，可根据实验条 件和要求选用。 (一)蛋白质透析 一.目的 学习透析的基本原理和操作。 二原理 蛋白质是大分子物质，不能透过透析膜而小分子物质可以自由透过。在分离提纯蛋白质 的过程中，常利用透析的方法使蛋白质与其中夹杂的小分子物质分开。 三仪器、试剂、材料 1.仪器 烧杯：玻棒：离心机：离心管：冰箱：电炉。 2.试剂 1%氯化钡溶液：疏酸铵粉末：1 mol/L EDTA:2%NaHCO,。 3材料 透析管（宽约2.5cm,长12-15cm)或玻璃纸皮筋：鸡蛋清溶液：将新鲜鸡蛋的蛋清 与水按1：20混匀，然后用六层纱布过滤。 四操作方法 1,透析管（前）处理：先将一适当大小和长度的透析管放在1 mol/L EDTA溶液中，煮 沸10分钟，再在2%NaHC0:溶液中煮沸10分钟，然后再在蒸馏水中煮沸10分 钟即可 2.取5ml蛋白质溶液于离心管中，加4g硫酸铵粉末，搅拌使之溶解。然后在4℃下静 置20分钟，出现絮状沉淀。 3.离心：将上述絮状沉淀液以1000转/分的速度离心20分钟。 4.装透析管：离心后倒掉上清夜，加5m蒸馏水溶解沉淀物，然后小心倒入透析管中， 扎紧上口 51 装好的透析管放入盛有蒸馏水的烧杯中，进行透析，并不断搅拌。 6.每隔适当时间(5一10分钟)，用氯化钡滴入烧杯的蒸馏水中，观察是否有沉淀现象。 五结果处理 记录并解释实验现象 六注意事项 1,硫酸铵盐一定要充分溶解，才能使蛋白质沉淀下来。 七思考题

实验十一 蛋白质脱盐 (透析和凝胶过滤) 在蛋白质的研究中，经常要进行蛋白质脱盐，即将蛋白质同其它盐类小分子分离开。蛋 白质脱盐的方法很多，各有优缺点。以下仅介绍常用的透析和凝胶过滤方法，可根据实验条 件和要求选用。 （一）蛋白质透析 一.目的 学习透析的基本原理和操作。 二. 原理 蛋白质是大分子物质，不能透过透析膜而小分子物质可以自由透过。在分离提纯蛋白质 的过程中，常利用透析的方法使蛋白质与其中夹杂的小分子物质分开。 三. 仪器、试剂、材料 1. 仪器 烧杯；玻棒；离心机；离心管；冰箱；电炉。 2. 试剂 1％氯化钡溶液；硫酸铵粉末；1mol/L EDTA；2%NaHCO3。 3. 材料 透析管（宽约 2.5cm，长 12－15cm）或玻璃纸;皮筋；鸡蛋清溶液：将新鲜鸡蛋的蛋清 与水按 1：20 混匀，然后用六层纱布过滤。 四. 操作方法 1. 透析管（前）处理：先将一适当大小和长度的透析管放在 1mol/L EDTA 溶液中，煮 沸 10 分钟，再在 2％ NaHCO3 溶液中煮沸 10 分钟，然后再在蒸馏水中煮沸 10 分 钟即可。 2. 取 5ml 蛋白质溶液于离心管中，加 4g 硫酸铵粉末，搅拌使之溶解。然后在 4℃下静 置 20 分钟，出现絮状沉淀。 3. 离心：将上述絮状沉淀液以 1000 转/分的速度离心 20 分钟。 4. 装透析管：离心后倒掉上清夜，加 5ml 蒸馏水溶解沉淀物，然后小心倒入透析管中， 扎紧上口。 5. 将装好的透析管放入盛有蒸馏水的烧杯中，进行透析，并不断搅拌。 6. 每隔适当时间（5－10 分钟），用氯化钡滴入烧杯的蒸馏水中，观察是否有沉淀现象。 五. 结果处理 记录并解释实验现象。 六. 注意事项 1. 硫酸铵盐一定要充分溶解，才能使蛋白质沉淀下来。 七. 思考题

在透析袋处理过程中，EDTA和NaHCO,起何作用？ (二)凝胶过滤 一.目的 学习凝胶过滤的基本操作技术，了解凝胶过滤脱盐的原理和应用。 二.原理 凝胶过滤的主要装置是填充有凝胶颗粒的层析柱。目前使用较多的凝胶有葡聚糖凝 胶(Sephadex)、琼脂糖凝胶(Sepharose)和聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gel-P)等。这些多 聚高分子材料，通过适当浓度的交联剂作用即产生分子间横向的交联，形成具有一定孔径 的网络结村 用这类材料制成粒状凝胶颗粒后 就形成 中三维网状结构 这些凝胶材料是高度亲水的，在水溶液里吸水显著膨胀。实际工作中常用每克干胶吸水 量(ml)的10倍(G值)表示凝胶的交联度，可根据被分离物质分子的大小和工作目 的，选择适合的凝胶型号。 当在柱项加上分子大小不同的混合物并用洗脱液洗脱时，自由通诱的小分子可以进 入胶粒内部，而受排阻的大分子不能进入胶粒内部。二者在洗脱过程中走过的路程差别 较大，大分子只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路程短，最先流出。而渗入胶料 内部的小分子受迷宫效应影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出。通 透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。从而按由大到小的顺序实现大小分子 分离。 凝胶过滤的操作条件温和，适于分离不稳定的化合物：凝胶颗粒不带电荷，不与被 分离物质发生反应，因而溶质回收率接近100%，而且设备简 、分离效果好、重现性 好，凝胶柱可反复使用，所以广泛使用于蛋白质等大分子的分离纯化、分子量测定、浓 缩、脱盐等用途。本实验利用凝胶过滤的特点，将NH)2SO4盐同蛋白质分子分离开。 三仪器、试剂、材料 1.仪器 层析柱（中2cm×15cm);真空泵：真空干燥器：恒流泵：核酸蛋白检测仪：部分收集 器：记录仪。 2试剂 1%氯化钡溶液：疏酸铵粉末：Sephadex G-25。 3.材料 鸡蛋清溶液：将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用六层纱布过滤 四.操作方法 1.凝胶溶张：取5 g Sephadex G-25.加200ml蒸貔水充分溶胀（在室温下约需6小时 或在沸水浴中溶胀5小时)。待溶胀平衡后，用倾泻法除去细小颗粒，在加入与凝 胶等体积的蒸馏 ，在真空干燥器中减压除 气，准备装柱 2.装柱：将层析柱垂直固定，旋紧柱下端的螺旋夹，加入14柱长的蒸馏水。把处理 好的凝胶连同适当体积的蒸馏水用玻棒搅匀，然后边搅拌边倒入柱中，同时开启螺 旋夹控制一定流量。最好一次连续装完所需的凝胶，若分次装入，需用玻棒轻轻搅

在透析袋处理过程中， EDTA 和 NaHCO3 起何作用？ （二）凝胶过滤 一. 目的 学习凝胶过滤的基本操作技术，了解凝胶过滤脱盐的原理和应用。 二. 原理 凝胶过滤的主要装置是填充有凝胶颗粒的层析柱。目前使用较多的凝胶有葡聚糖凝 胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）和聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel-P）等。这些多 聚高分子材料,通过适当浓度的交联剂作用即产生分子间横向的交联，形成具有一定孔径 的网络结构。当用这类材料制成粒状凝胶颗粒后，颗粒内部就形成一种三维网状结构。 这些凝胶材料是高度亲水的，在水溶液里吸水显著膨胀。实际工作中常用每克干胶吸水 量（ml）的 10 倍（G 值）表示凝胶的交联度，可根据被分离物质分子的大小和工作目 的，选择适合的凝胶型号。 当在柱顶加上分子大小不同的混合物并用洗脱液洗脱时，自由通透的小分子可以进 入胶粒内部，而受排阻的大分子不能进入胶粒内部。二者在洗脱过程中走过的路程差别 较大，大分子只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路程短，最先流出。而渗入胶粒 内部的小分子受迷宫效应影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出。通 透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。从而按由大到小的顺序实现大小分子 分离。 凝胶过滤的操作条件温和，适于分离不稳定的化合物；凝胶颗粒不带电荷，不与被 分离物质发生反应，因而溶质回收率接近 100％，而且设备简单、分离效果好、重现性 好，凝胶柱可反复使用，所以广泛使用于蛋白质等大分子的分离纯化、分子量测定、浓 缩、脱盐等用途。本实验利用凝胶过滤的特点，将(NH4)2SO4 盐同蛋白质分子分离开。 三. 仪器、试剂、材料 1. 仪器 层析柱（ф2cm×15cm）;真空泵；真空干燥器；恒流泵；核酸蛋白检测仪；部分收集 器；记录仪。 2. 试剂 1％氯化钡溶液；硫酸铵粉末；Sephadex G-25。 3. 材料 鸡蛋清溶液：将新鲜鸡蛋的蛋清与水按 1：20 混匀，然后用六层纱布过滤。 四. 操作方法 1. 凝胶溶胀：取 5 g Sephadex G-25, 加 200ml 蒸馏水充分溶胀（在室温下约需 6 小时 或在沸水浴中溶胀 5 小时）。待溶胀平衡后，用倾泻法除去细小颗粒，在加入与凝 胶等体积的蒸馏水，在真空干燥器中减压除气，准备装柱。 2. 装柱：将层析柱垂直固定，旋紧柱下端的螺旋夹，加入 1/4 柱长的蒸馏水。把处理 好的凝胶连同适当体积的蒸馏水用玻棒搅匀，然后边搅拌边倒入柱中，同时开启螺 旋夹控制一定流量。最好一次连续装完所需的凝胶，若分次装入，需用玻棒轻轻搅

动柱床上层凝胶，以免出现界面影响分离效果。最后放入略小于层析柱内径的滤纸 片保护凝胶床面】 平衡：维续用蒸馏水洗脱，调整流量使胶床表面保持2cm液层，平衡20分钟， 4.样品制备：取5ml蛋白质溶液于离心管中，加4g硫酸铵粉末，搅拌使之溶解。然 后在4℃下静置20分钟，出现絮状沉淀。将上述絮状沉淀液以1000转/分的速度离 心20分钟，离心后倒掉上清夜，加5ml蒸馏水溶解沉淀物，即为样品。 5.上样：当胶床表面仅留约1mm液层时，吸取1ml样品，小心地注入层析柱胶床面 中央，慢慢打开螺 待大 部分样品进入胶床、床面上 仪有 n液层时，用 头滴管加入少量蒸馏水，使剩余样品进入胶床，然后用滴管小心加入3一5Cm高的 洗脱液。 6.洗脱：继续用蒸馏水洗脱，调整流速，使上下流速同步。用核酸蛋白检测仪检测， 同时用部分收集器收集洗脱液。合并与峰值相对应的试管中的洗脱液，即为脱盐后 )白部渍蛋白质游流，评价苑盐效果】 五结果处理 记录并解释实验现象，讨论凝胶过滤的脱盐效果。 六.注意事项 1.整个操作过程中凝胶必须处于溶液中，不得暴露于空气，否则将出现气泡和断层， 应当重新装柱。 2.加样时应小心注入床面中央，注意切勿冲动胶床。 七.思考题 影响凝胶过滤脱盐效果的因素有邦些？

动柱床上层凝胶，以免出现界面影响分离效果。最后放入略小于层析柱内径的滤纸 片保护凝胶床面。 3. 平衡：继续用蒸馏水洗脱，调整流量使胶床表面保持 2cm 液层，平衡 20 分钟。 4. 样品制备：取 5ml 蛋白质溶液于离心管中，加 4g 硫酸铵粉末，搅拌使之溶解。然 后在 4℃下静置 20 分钟，出现絮状沉淀。将上述絮状沉淀液以 1000 转/分的速度离 心 20 分钟，离心后倒掉上清夜，加 5ml 蒸馏水溶解沉淀物，即为样品。 5. 上样：当胶床表面仅留约 1mm 液层时，吸取 1ml 样品，小心地注入层析柱胶床面 中央，慢慢打开螺旋夹，待大部分样品进入胶床、床面上仅有 1mm 液层时，用乳 头滴管加入少量蒸馏水，使剩余样品进入胶床，然后用滴管小心加入 3－5cm 高的 洗脱液。 6. 洗脱：继续用蒸馏水洗脱，调整流速，使上下流速同步。用核酸蛋白检测仪检测， 同时用部分收集器收集洗脱液。合并与峰值相对应的试管中的洗脱液，即为脱盐后 的蛋白质溶液。 7. 用氯化钡溶液检测蛋白质溶液，评价脱盐效果。 五. 结果处理 记录并解释实验现象，讨论凝胶过滤的脱盐效果。 六. 注意事项 1. 整个操作过程中凝胶必须处于溶液中，不得暴露于空气，否则将出现气泡和断层， 应当重新装柱。 2. 加样时应小心注入床面中央，注意切勿冲动胶床。 七. 思考题 影响凝胶过滤脱盐效果的因素有那些？