河南农业大学：《生物化学》课程教学资源（实验指导）实验七 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较

实验七小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 一、目的 1.,学习分光光度计的原理和使用方法。 2.学习测定淀粉酶活力的方法。 3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化 二、原理 种子中贮藏的碳水化合物主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。 2 (CoHioOs)n+H2O-nC12Hz2Ou 麦芽糖有还原性，能使3,5-二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基5硝基水扬酸。后 者可用分光光度计法测定。 COOH COOH O.NNO. o,N入NH 休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，南活力逐渐增强，并随着发芽天 数的增长而增加。 本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。 三、器材 1.25毫升刻度试管 2.吸管 3.乳体。 4离心管。 5.分光光度计。 6.离心机。 7.恒温水浴 四、试剂 1.0.1%标准麦芽糖溶液20毫升：精确称量100毫克麦芽糖，用少量水溶解后， 移入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。 2.pH6.9, 0.02摩尔/L磷酸缓冲液100毫升 3.1%淀粉溶液100毫升：1克可溶性淀粉溶于100毫升0.02摩尔/L磷酸缓冲液， 其中含有0.006摩尔/L氯化钠。 4.1%3.,5二硝基水杨酸试剂：1g3,5.二硝基水杨酸溶于20毫升2摩尔/L的氢氧 化钠溶液和50毫升水中：再加人30克酒石酸钾钠，定客至100毫升。若溶液混浊，可 过滤。 5.1%氯化钠溶液300毫升 6.海砂5克 五、操作步骤

实验七 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 一、目 的 1．学习分光光度计的原理和使用方法。 2．学习测定淀粉酶活力的方法。 3．了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、原 理 种子中贮藏的碳水化合物主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。 2（C6H10O5）n＋H2O-nC12H22O11 麦芽糖有还原性，能使 3,5-二硝基水杨酸还原成棕色的 3-氨基 5-硝基水扬酸。后 者可用分光光度计法测定。 休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天 数的增长而增加。 本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。 三、器 材 1．25 毫升刻度试管。 2．吸管。 3．乳体。 4．离心管。 5．分光光度计。 6．离心机。 7．恒温水浴。 四、试 剂 1. 0.1％标准麦芽糖溶液 20 毫升：精确称量 100 毫克麦芽糖，用少量水溶解后， 移入 100ml 容量瓶中，加蒸馏水至刻度。 2．pH 6.9，0.02 摩尔／L 磷酸缓冲液 100 毫升 3．l％淀粉溶液 100 毫升：1 克可溶性淀粉溶于 100 毫升 0.02 摩尔／L 磷酸缓冲液， 其中含有 0.006 摩尔／L 氯化钠。 4．l％3,5-二硝基水杨酸试剂: 1g 3,5-二硝基水杨酸溶于 20 毫升 2 摩尔／L 的氢氧 化钠溶液和 50 毫升水中；再加人 30 克酒石酸钾钠，定客至 100 毫升。若溶液混浊，可 过滤。 5．l％氯化钠溶液 300 毫升 6．海砂 5 克 五、操作步骤

1.种子发芽： 小麦种子浸泡2.5小时后，放人25℃恒温箱内或在室温下发芽。 2 酵液提取 取发芽第 或第四天的幼苗15株，放人乳体内，加海砂20毫克，加1%氯化 钠溶液10毫升，用力磨碎。在室温下放置20分钟，搅拌几次。将提取液离心(1500 转/mn)6一7分钟。将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时， 将酶提取液稀释10倍 取干燥种子或浸泡2.5小时后的种子15粒作为对照（提取步骤同上）。 3。酶活力测定 (1)取25毫升刻度试管4支。编号。按下表要求加人各试剂（各试剂须25℃预 热10分钟)。 2 3 4 试 剂 玉操种子（感 标准管 空白管 酶提取液 酶液（毫升） 0.5 0.5 标准麦芽糖溶液（毫升 0.5 1%淀粉溶液（毫升） 1 1 1 水（毫升） 一 0.5 将各管混匀，放在25℃，水浴中保温3分钟后，立即向各管中加人10%3,5二硝基水 杨酸溶液2毫升 (2)取出各试管，放人沸水浴中加热5分钟。冷至室温，加水稀释至25毫升。 将各管充分混匀。 试管号 赞费子的四天幼苗的酶 3,标准 4.空白 S0m光吸收值 (3)用空白管作对照：在500毫微米处测定各管的光吸收值，将读数填人上 表。 4.计算 根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：A幕/A来知=C精/C :则C(酶液管浓度)=A×C落/A 式中C代表浓度：A为光吸收值

1．种子发芽： 小麦种子浸泡 2.5 小时后，放人 25℃恒温箱内或在室温下发芽。 2．酶液提取： 取发芽第三天或第四天的幼苗 15 株，放人乳钵内，加海砂 200 毫克，加 1％氯化 钠溶液 10 毫升，用力磨碎。在室温下放置 20 分钟，搅拌几次。将提取液离心（l500 转／min）6－7 分钟。将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时， 将酶提取液稀释 10 倍。 取干燥种子或浸泡 2.5 小时后的种子 15 粒作为对照（提取步骤同上）。 3．酶活力测定： （1）取 25 毫升刻度试管 4 支。编号。按下表要求加人各试剂（各试剂须 25℃预 热 10 分钟）。 将各管混匀，放在 25℃，水浴中保温 3 分钟后，立即向各管中加人 10％3,5-二硝基水 杨酸溶液 2 毫升。 （2）取出各试管，放人沸水浴中加热 5 分钟。冷至室温，加水稀释至 25 毫升。 将各管充分混匀。 （3）用空白管作对照；在 500 毫微米处测定各管的光吸收值，将读数填人上 表。 4．计算 根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：A 标准／A 未知＝C 标准／C 未知 ：则 C（酶液管浓度）＝A 酶×C 标准／A 标准 式中 C 代表浓度；A 为光吸收值