河南农业大学：《生物化学》课程教学资源（实验指导）实验十二 聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验十二聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、目的 了解聚丙烯酰胺盘状电泳的基本原理和操作技术。 二、原理 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量交联剂在催化剂和 加速剂的作用下发生聚合反应而制得的。聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径可用 改变凝胶液中单体的浓度来加以控制。一般分离蛋白质选用7.5%聚丙烯酰胺凝胶，分离比 较大的分子，如核糖体核酸时则用2.5%凝胶。 凝胶电泳分辨力较高。 三、器材 1.电泳仪(600V)及盘状电泳电泳槽。 2.电泳玻璃管（用碱性较低的玻璃管），内径5一7毫米，长80一100毫米。 3.玻璃架（制胶时用来垂直插放玻璃管）。 4.微量注射器或微量吸管。 5.带长针头的注射器。 6.日光灯。 7.带有玻璃珠或玻璃棒的一小段乳胶管」 四、试剂和材料 1.唾液。 2.贮液和工作溶液：按下页表配制。 五、操作方法 一般先制分离胶，再在分离胶上面制作浓缩胶。 1.分离胶的制备 将贮液由冰箱取出等达到室温后再按下表中的比例配制工作溶液。先将分离胶液与过 硫酸分别放在真空干燥器中。待抽出溶解的空气后取出，赶快混匀，用带长针头的注射器吸 取一定量的胶液，沿着管壁加到预先准备好的玻璃管中（玻璃管的一端用带有玻璃珠或小段 玻璃棒的乳胶管塞住，乳胶管中加二滴40%蔗糖后插在玻璃架上)，灌入的分离胶液高约6.5 厘米，然后立即用带弯针头的小注射器在已加入的分离胶液面上，距胶面约O.1厘米处沿管 壁缓缓加人3一5毫米高的蒸馏水层，切忌使加入之水呈滴状坠入胶液，这样会使顶部凝胶 浓度变稀，改变凝胶孔径。 水层放好后，静置胶液使进行聚合反应。正常情况下10分钟开始聚合，应控制在30 分钟到1小时内完成聚合。 刚加水时看出有界面，后逐渐消失。等到再看出界面时表明凝胶己经聚合，再静置30 分钟便聚合完全

实验十二 聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、目 的 了解聚丙烯酰胺盘状电泳的基本原理和操作技术。 二、原 理 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量交联剂在催化剂和 加速剂的作用下发生聚合反应而制得的。聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径可用 改变凝胶液中单体的浓度来加以控制。一般分离蛋白质选用 7.5％聚丙烯酰胺凝胶，分离比 较大的分子，如核糖体核酸时则用 2.5％凝胶。 凝胶电泳分辨力较高。 三、器 材 1．电泳仪（600V）及盘状电泳电泳槽。 2．电泳玻璃管（用碱性较低的玻璃管），内径 5－7 毫米，长 80－100 毫米。 3．玻璃架（制胶时用来垂直插放玻璃管）。 4．微量注射器或微量吸管。 5．带长针头的注射器。 6．日光灯。 7．带有玻璃珠或玻璃棒的一小段乳胶管。 四、试剂和材料 1．唾液。 2．贮液和工作溶液：按下页表配制。 五、操作方法 一般先制分离胶，再在分离胶上面制作浓缩胶。 l. 分离胶的制备 将贮液由冰箱取出等达到室温后再按下表中的比例配制工作溶液。先将分离胶液与过 硫酸分别放在真空干燥器中。待抽出溶解的空气后取出，赶快混匀，用带长针头的注射器吸 取一定量的胶液，沿着管壁加到预先准备好的玻璃管中（玻璃管的一端用带有玻璃珠或小段 玻璃棒的乳胶管塞住，乳胶管中加二滴 40％蔗糖后插在玻璃架上），灌入的分离胶液高约 6．5 厘米，然后立即用带弯针头的小注射器在已加入的分离胶液面上，距胶面约 0.l 厘米处沿管 壁缓缓加人 3－5 毫米高的蒸馏水层，切忌使加入之水呈滴状坠入胶液，这样会使顶部凝胶 浓度变稀，改变凝胶孔径。 水层放好后，静置胶液使进行聚合反应。正常情况下 10 分钟开始聚合，应控制在 30 分钟到 1 小时内完成聚合。 刚加水时看出有界面，后逐渐消失。等到再看出界面时表明凝胶已经聚合，再静置 30 分钟便聚合完全

贮液 100ml溶液中的含量 p 工作溶液混合比 1moL盐酸 48ml 小乳的《分离胶】 T 36.6g 89 1份1号贮液 TEMED 0.23ml 2份2号 280% 1份水 2 Bis 0.753g 4份3号贮液 3 过硫酸 0.14g p8.9,凝胶浓度7% 1moL盐酸 48ml 59% 大孔乳胶（浓缩胶 67 1份4号贮液 TEMED 0.23ml 2份5号贮液 Ag 10.0g 1段6号贮液 Bis 25g 47号贮液 6 核黄素 40 p6,7凝胶浓度2.5% 芒糖 40g 电极缓冲液 T 甘氨酸 288 3 用时稀10倍 加水到1 2，浓缩胶的制各 用注射器吸去分离胶上的水层，用滤纸条吸去残留的水液（滤纸不要接触胶 面)。 按比例混匀浓缩胶液（也预先抽气，抽气时不要与核黄素混合，抽完气后再 混合)，先用这种胶液很快漂洗一下分离胶的项部，除去漂洗液后，按上法加人浓 缩胶液约0.5-1厘米高，并立即仔细加水层。然后在距管10厘米处用日光灯照射 进行光聚合。正常情况下照射6一7分钟就可看到浓缩胶显乳白色，表明聚合开始。 继续照半小时，使聚合完全 除去水层，吸干后用上电极槽缓冲液洗涤，再将这种缓冲液加至管顶，在室 温放置0.5一1小时就可使用。 浓缩胶应在临用前制备。 3。加样 盘状电泳所需样品很少，用1毫克/毫升浓度的样品液每管需5一100微升， 加样前先把玻璃管下边的橡胶塞除去，要注意先拉开乳胶管使空气进人，再 拔下米，防止将凝胶拉坏。下槽中放满缓冲液，把管固定在上槽的洞中，要保证 凝胶管垂直和橡皮塞孔密封不漏。管的下端悬上一滴缓冲液，再把上槽放在下槽 上，避免管下有气泡。管中凝胶表面上部及上槽灌满电极缓冲液。 将4号贮液1份，水3份，20%蔗糖溶液4份，混和，然后取唾液3微升 加上述混合液0.15毫升，混匀后小心地加在浓缩胶与电极缓冲液界面处，因样品 液比重大，即平铺在凝胶表面。 指示染料一般用溴酚蓝或酚红，通常每管加0.1%的染料溶液0.005毫升，指 示染料与样品混合后加人。 4.电泳

贮液 100ml 溶液中的含量 pH 工作溶液混合比 1 1mol/L 盐酸 48ml 8.9 小孔乳胶（分离胶） 1 份 1 号贮液 2 份 2 号贮液 1 份水 4 份 3 号贮液 pH8.9，凝胶浓度 7％ Tris 36.6g TEMED 0.23ml 2 Acr 28.0g Bis 0.753g 3 过磷酸铵 0.14g 4 1mol/L 盐酸 48ml 6.7 大孔乳胶（浓缩胶） 1 份 4 号贮液 2 份 5 号贮液 1 份 6 号贮液 4 份 7 号贮液 pH6.7，凝胶浓度 2.5％ Tris 5.98g TEMED 0.23ml 5 Acr 10.0g Bis 2.5g 6 核黄素 4.0g 7 蔗糖 40g 电极缓冲液 Tri 6.0g 甘氨酸 28.8g 加水到 1 L 8.3 用时稀释 10 倍 2．浓缩胶的制备 用注射器吸去分离胶上的水层，用滤纸条吸去残留的水液（滤纸不要接触胶 面）。 按比例混匀浓缩胶液（也预先抽气，抽气时不要与核黄素混合，抽完气后再 混合），先用这种胶液很快漂洗一下分离胶的顶部，除去漂洗液后，按上法加人浓 缩胶液约 0.5－l 厘米高，并立即仔细加水层。然后在距管 10 厘米处用日光灯照射 进行光聚合。正常情况下照射 6－7 分钟就可看到浓缩胶显乳白色，表明聚合开始。 继续照半小时，使聚合完全。 除去水层，吸干后用上电极槽缓冲液洗涤，再将这种缓冲液加至管顶，在室 温放置 0. 5—1 小时就可使用。 浓缩胶应在临用前制备。 3．加样 盘状电泳所需样品很少，用 1 毫克／毫升浓度的样品液每管需 5—100 微升。 加样前先把玻璃管下边的橡胶塞除去，要注意先拉开乳胶管使空气进人，再 拔下来，防止将凝胶拉坏。下槽中放满缓冲液，把管固定在上槽的洞中，要保证 凝胶管垂直和橡皮塞孔密封不漏。管的下端悬上一滴缓冲液，再把上槽放在下槽 上，避免管下有气泡。管中凝胶表面上部及上槽灌满电极缓冲液。 将 4 号贮液 1 份，水 3 份，20％蔗糖溶液 4 份，混和，然后取唾液 3 微升， 加上述混合液 0.15 毫升，混匀后小心地加在浓缩胶与电极缓冲液界面处，因样品 液比重大，即平铺在凝胶表面。 指示染料一般用溴酚蓝或酚红，通常每管加 0.l％的染料溶液 0.005 毫升，指 示染料与样品混合后加人。 4．电泳

加完样后接通电源，负极在上，正极在下。调节电流，开始时用1一2毫安/ 管，电泳一2分钟，再升高电流到约3一5毫安/管，不要一开始电流很高。电洗 最好不超过5毫安， 以免产 热过多 必要时应进行冷却或在冷库内进行 当指示染料迁移到凝胶柱的下端附近时就可停止电泳，关闭电源，取出玻管。 缓冲液可再行使用，但上下槽缓冲液不能混淆，因下槽缓冲液中已混人催化 剂及氯离子（快离子），如将它当作上槽液就要影响电泳效果。 5轻胶的取出 将一针头长约10厘米的注射器吸满水。将针头插入凝胶与管壁之间，并紧则 管壁，一面注入水一面慢慢旋转玻管并推针前进，靠水流压力和润滑作用使玻窄 内壁与凝胶分开，待水从玻管一端流出时，再慢授将针头退出。然后去掉针头， 用注射器向玻管中快速注射水，将凝胶压出玻管。如凝胶浓度较高，取出困难， 可用10%的甘油水溶液代替水注入。一般剥胶方向是从浓缩胶端开始。 6.固定 为防止凝胶柱内已分离成分的扩散，需进行固定。方法是：把剥出的凝胶村 浸泡在7%乙酸或12.5%三氯乙酸的水溶液中几分钟：或浸泡在用7%乙酸或 12.5%三氯乙酸液配制的染色液中，同时进行固定和染色。 7色 在6%乙酸（含1%考马斯蓝）中染色30min,用甲醇：水：浓氨水(64：36： 1)脱色1-2天

加完样后接通电源，负极在上，正极在下。调节电流，开始时用 l－2 毫安／ 管，电泳 l—2 分钟，再升高电流到约 3－5 毫安／管，不要一开始电流很高。电流 最好不超过 5 毫安，以免产热过多，必要时应进行冷却或在冷库内进行。 当指示染料迁移到凝胶柱的下端附近时就可停止电泳，关闭电源，取出玻管。 缓冲液可再行使用，但上下槽缓冲液不能混淆，因下槽缓冲液中已混人催化 剂及氯离子（快离子），如将它当作上槽液就要影响电泳效果。 5．凝胶的取出 将一针头长约 10 厘米的注射器吸满水。将针头插入凝胶与管壁之间，并紧贴 管壁，一面注入水一面慢慢旋转玻管并推针前进，靠水流压力和润滑作用使玻管 内壁与凝胶分开，待水从玻管一端流出时，再慢慢将针头退出。然后去掉针头， 用注射器向玻管中快速注射水，将凝胶压出玻管。如凝胶浓度较高，取出困难， 可用 10％的甘油水溶液代替水注入。一般剥胶方向是从浓缩胶端开始。 6．固定 为防止凝胶柱内已分离成分的扩散，需进行固定。方法是：把剥出的凝胶柱 浸泡在 7％乙酸或 12．5％三氯乙酸的水溶液中几分钟；或浸泡在用 7％乙酸或 12．5％三氯乙酸液配制的染色液中，同时进行固定和染色。 7．染色 在 6%乙酸（含 1%考马斯蓝）中染色 30min，用甲醇：水：浓氨水（64：36： 1）脱色 1-2 天