河南农业大学：《生物化学》课程教学资源（实验指导）实验六 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G－250法）

实验六蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G一250法） 一、目的 蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量 分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临 床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G 一250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较 好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光 度计的结构、原理和在比色法中的应用。 二、原理 考马斯亮蓝G一250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。 蛋白质含量在0~1000μg范围内，蛋白质一色素结合物在595m下的吸光度与蛋白质含量 成正比，故可用比色法测定。 三、仪器、试剂和材料 1.仪器 (1)分析天平 (2)具塞刻度试管 10ml×8 (3)吸管0.lml×1,lml×Z,5ml×1 (4)研体 (5)漏斗 (6)离心管 10ml (7)容量瓶 10ml (8)离心机 (9)721型分光光度计 2.试剂 (1)标准蛋白质溶液称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml,制 成100p%/ml的原液。 (2)考马斯亮蓝G-250蛋白试剂称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50ml90% 乙醇中，加入85%(m/v)的磷酸100ml,最后用蒸馏水定容到1000ml。 此溶液在常温下可放置一个月。 3.材料 绿豆芽 四、操作步骤 1.标准曲线的制作取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。 管号 操作项目 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质溶液(m) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水(m 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 G-250试剂(m 各5 蛋白质含量(“g) 0 20 40 60 80 100

实验六 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝 G－250 法） 一、目的 蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量 分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临 床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝 G －250 法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较 好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝 G－250 法测定蛋白质含量的原理，了解分光光 度计的结构、原理和在比色法中的应用。 二、原理 考马斯亮蓝 G－250 是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。 蛋白质含量在 0～1000μg 范围内，蛋白质一色素结合物在 595nm 下的吸光度与蛋白质含量 成正比，故可用比色法测定。 三、仪器、试剂和材料 1．仪器 （1）分析天平 （2）具塞刻度试管 10ml× 8 （3）吸管 0.lml×I，lml×Z，5ml×I （4）研钵 （5）漏斗 （6）离心管 10ml （7）容量瓶 10ml （8）离心机 （9）721 型分光光度计 2．试剂 （1）标准蛋白质溶液 称取 10mg 牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至 100ml，制 成 100 pg／ml 的原液。 （2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml 90％ 乙醇中，加入 85％（m／v）的磷酸 100ml，最后用蒸馏水定容到 1000ml。 此溶液在常温下可放置一个月。 3．材料 绿豆芽 四、操作步骤 1．标准曲线的制作 取 6 支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。 操作项目 管 号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质溶液(ml) 0 0.2 0.4 0. 6 0.8 1.0 蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 G-250 试剂(ml) 各 5 蛋白质含量（μg） 0 20 40 60 80 100

盖上塞子，摇匀。放置2min后在595nm波长下比色测定（比色应在Ih内完成）。 以牛血清白蛋白含量（μg)为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。 2.样品中蛋白质含量的测定 (1)准确称取约200mg绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀 浆，离心(4000r/min,10min),将上清液倒入10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水， 悬浮后再离心l0min,合并上清液，定客至刻度。 (2)另取1支具塞试管，准确加入0lml样品提取液，再加入0.9ml蒸馏水，5ml考 马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2mn后，以标准曲线1号试管做参比，在595nm 波长下比色，记录吸光度。 五、结果处理 根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg),按下式 计算： 样品蛋白质含量（μg/g鲜重）=（查得的蛋白质含量（μg)×提取液总体积(ml) /(样品鲜重(g)×测定时取用提取液的体积(ml) 六、注意事项 比色应在出现蓝色2min~lh内完成。 七、思考题 1.考马斯亮蓝G一250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？ 2.如何正确使用分光光度计？ 参考文献 鲁子贤。蛋白质化学。北京：科学出版社，1981 文树基。基础生物化学实验指导。西安：陕西科学技术出版社，1994 张龙翔.生物化学实验技术。北京：人民教育出版社，1981

盖上塞子，摇匀。放置 2min 后在 595 nm 波长下比色测定（比色应在 l h 内完成）。 以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。 2．样品中蛋白质含量的测定 （1）准确称取约 200mg 绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入 5ml 蒸馏水在冰浴中研成匀 浆，离心（4000r／min，10min），将上清液倒入 10ml 容量瓶，再向残渣中加入 2ml 蒸馏水， 悬浮后再离心 10min，合并上清液，定客至刻度。 （2）另取 1 支具塞试管，准确加入 0.l ml 样品提取液，再加入 0.9 ml 蒸馏水，5ml 考 马斯亮蓝 G－250 试剂，充分混合，放置 2min 后，以标准曲线 1 号试管做参比，在 595 nm 波长下比色，记录吸光度。 五、结果处理 根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按下式 计算： 样品蛋白质含量（μg／g 鲜重）＝（查得的蛋白质含量（μg）×提取液总体积（ml）） ／（样品鲜重（g）×测定时取用提取液的体积（ml）） 六、注意事项 比色应在出现蓝色 2 min～l h 内完成。 七、思考题 1．考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？ 2．如何正确使用分光光度计？ 参考文献 鲁子贤。蛋白质化学。北京：科学出版社，1981 文树基。基础生物化学实验指导。西安：陕西科学技术出版社，1994 张龙翔．生物化学实验技术。北京：人民教育出版社，1981