河南农业大学：《生物化学》课程教学资源（实验指导）实验四 甲醛滴定法测定氨基氮

实验四甲醛滴定法测定氨基氮 一.目的 初步掌握甲醛滴定法测定氨基氮含量的原理和操作要点。 三原理 氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡 R-CH-C00≥R-CH-C00+H NH3 NH2 基酸 常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使 -NH释放T,使溶液的酸度增加，滴定中和终点移至酚酞的变色域内(PH9.0左右)。因 此可用酚酞作指示剂，用标淮氢氧化钠溶液滴定。 R-CH-C0OR-CH-C00+H NaOH 之中和 12 HCHO R-CH-000 HCHO R-CH-C0O- N(CH20H)2 如样品为一种己知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氨的含量。如样品为多种氨 基酸的混合物如蛋白质水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但此法简便快速， 常用来测定蛋白质的水解程度，随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表明 水解作用已完全。 三仪器、试剂、材料 1.仪器 25ml锥形瓶：3ml微量滴定管：吸管：研体 2.试剂 (1)300ml0.05molL标准甘氨酸溶液 准确称取375mg甘氨酸，溶解后定容至100ml。 (2)500ml0.02mol/L标准氢氧化钠溶液 (3)20ml酚指示剂 0.5%酚酞的50%乙醇溶液 (4)400ml中性甲醛溶液 在50ml36-37%分析纯甲醛溶液中加入1ml0.5%酚酞乙醇水溶液，用 0.02moL的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中

实验四 甲醛滴定法测定氨基氮 一.目的 初步掌握甲醛滴定法测定氨基氮含量的原理和操作要点。 二. 原理 氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡： －NH3 是弱酸，完全解离时 PH 为 11－12 或更高，若用碱滴定－NH3 所释放的 H ＋来测定氨 基酸，一般指示剂变色域小于 10，很难准确指示滴定终点。 常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使 －NH3 释放 H ＋，使溶液的酸度增加，滴定中和终点移至酚酞的变色域内（PH9.0 左右）。因 此可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。 如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。如样品为多种氨 基酸的混合物如蛋白质水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但此法简便快速， 常用来测定蛋白质的水解程度，随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表明 水解作用已完全。 三. 仪器、试剂、材料 1. 仪器 25ml 锥形瓶；3ml 微量滴定管；吸管；研钵。 2. 试剂 (1) 300ml 0.05mol/L 标准甘氨酸溶液 准确称取 375mg 甘氨酸，溶解后定容至 100ml。 (2) 500ml 0.02mol/L 标准氢氧化钠溶液 (3) 20ml 酚酞指示剂 0.5 ％酚酞的 50 ％乙醇溶液 (4) 400 ml 中性甲醛溶液 在 50ml 36－37 ％分析纯甲醛溶液中加入 1ml 0.5％酚酞乙醇水溶液，用 0.02mol/L 的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中

四操作方法 1. 取3个25m的锥形瓶，编号。向1、2号瓶内各加入005molL标准甘氨酸溶液 2ml和水5ml,混匀。问3号瓶内加入7m水。然后向三个瓶中各加入5滴酚酞指 示剂，混匀后各加2ml甲醛溶液再混匀，分别用0.02molL标准氢氧化钠溶液滴定 军容商思微行色 重复以上实验两次，记录每次每瓶消耗的标准氢氧化钠溶液的毫升数。取平均值， 计算甘氨酸氨基氨的回收率。 2 取未知浓度的甘氨酸溶液2ml,依上述方法进行测定，平行做几份，取平均值。计 算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克数。 五结果处理 1.回收率计算 实际测得量 甘氨酸氨基氨回收率%三 ·×100 加入理论量 公式中实际测得量为滴定1和2号瓶耗用的标淮氢氧化钠溶液毫升数的平均值与第 3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度，再乘以 14008 2.氨基氮计算： 氨基氨（毫克/毫升）=V-VXNo0mX14008 公式中V为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均幸升数。V为滴定对照液 (3号瓶)耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。八NO为标准氧氧化钠溶液的摩尔浓 六注意事项 1.标准氢氧化钠溶液应在使用前标定，并在密闭瓶中保存。不可使用隔日贮在微量滴 定管中的剩余氢氧化钠。 2.中性甲醛溶液在临用前配制，若己放置一段时间，则使用前需要重新中和。 3.本实验为定量实验，甘氨酸和氢氧化钠的浓度要严格标定，加量要准确，全部操作 要按分析化学要求进行。 4.脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定毫升数偏低。而酪氨酸的滴定毫升 数结果偏高 七.思考题 甲醛滴定法为什么不能准确测定含有多种氨基酸的样品中的氨基氨？

四.操作方法 1. 取 3 个 25 ml 的锥形瓶，编号。向 1、2 号瓶内各加入 0.05mol/L 标准甘氨酸溶液 2ml 和水 5ml，混匀。向 3 号瓶内加入 7 ml 水。然后向三个瓶中各加入 5 滴酚酞指 示剂，混匀后各加 2 ml 甲醛溶液再混匀，分别用 0.02mol/L 标准氢氧化钠溶液滴定 至溶液显微红色。 重复以上实验两次，记录每次每瓶消耗的标准氢氧化钠溶液的毫升数。取平均值， 计算甘氨酸氨基氮的回收率。 2. 取未知浓度的甘氨酸溶液 2ml，依上述方法进行测定，平行做几份，取平均值。计 算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克数。 五. 结果处理 1. 回收率计算： 甘氨酸氨基氮回收率％＝ 实际测得量 ×100 加入理论量 公式中实际测得量为滴定1和2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数的平均值与第 3 号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度，再乘以 14.008。 2. 氨基氮计算： 氨基氮（毫克/毫升）= （V 未－V 对）×NNaOH×14.008 2 公式中 V 未为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。V 对为滴定对照液 （3 号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。NNaOH 为标准氢氧化钠溶液的摩尔浓 度。 六. 注意事项 1. 标准氢氧化钠溶液应在使用前标定，并在密闭瓶中保存。不可使用隔日贮在微量滴 定管中的剩余氢氧化钠。 2. 中性甲醛溶液在临用前配制，若已放置一段时间，则使用前需要重新中和。 3. 本实验为定量实验，甘氨酸和氢氧化钠的浓度要严格标定，加量要准确，全部操作 要按分析化学要求进行。 4. 脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定毫升数偏低。而酪氨酸的滴定毫升 数结果偏高。 七. 思考题 甲醛滴定法为什么不能准确测定含有多种氨基酸的样品中的氨基氮？