河南农业大学：《生物化学》课程教学资源（实验指导）实验十 脲酶Km值测定

实验十脲酶Km值测定 一、目的 脲酶是氨素循环的一种关键性酶，它催化尿素与水作用生成碳酸铵，在促进 土壤和植物体内尿素的利用上起有重要作用。对其进行多方面研究，早己引起人 们重视。通过本实验，学习脲酶Km值的测定方法。 二、原理 脲酶催化下列反应： 0NH,C0+2H0NH,c0, 在碱性条件下，碳酸铵与奈氏试剂作用产生橙黄色的碘化双汞铵。在一定范 围内 深浅与碳酸铵量成正 故可用比色法测定单位时间内酶促反应所产 生的碳酸铵量，从而求得酶促反应速度。 (NH)2CO,+8NaOH+4(KI)2Hgl2- Hg 20 NH2I +6Nal +8KI+NazCO+6H2O 橙黄色) 在保持恒定的最适条件下，用相同浓度的脲酶催化不同浓度的尿素发生水合 反应。在一定限度内，酶促反应速度与脲浓度成正比。用双倒数作图法可求得脲 酶的Km值。 三、仪器、试剂和材料 1.仪器 1)试管 16×160mm21支 (2)吸管0.5ml×15,1ml×1,Zml×1,10ml×1 (3)漏斗5个 (4)721型分光光度计 (5)电热恒温水浴 (6)离心机 (7)康氏振荡机 2.试剂 (1)1/10mol/L脲 15.015g,水溶后定容至250ml (2)不同浓度脲液 用1/10mol/L脲稀释成1/20、1/30、1/ 40、1/50mol/L的脲液。 (3)1/15mo/LpH7.0磷酸盐缓冲液NaHPO45.969g,水落后定 容至250ml。NaHP0:2.268g,水溶后定容至250ml.取Na:HPO4溶液60ml, NaH:PO,溶液40ml混匀 ,即为1/15mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液。 (4)10%疏酸锌 20gZnS04溶于200ml蒸馏水中。 (5)0.5mol/L氢氧化钠5 gNaOH,水溶后定容至250ml。 (6)10%酒石酸钾钠 20g酒石酸钾钠溶于200ml蒸馏水中

实验十 脲酶 Km 值测定 一、目的 脲酶是氮素循环的一种关键性酶，它催化尿素与水作用生成碳酸铵，在促进 土壤和植物体内尿素的利用上起有重要作用。对其进行多方面研究，早已引起人 们重视。通过本实验，学习脲酶 Km 值的测定方法。 二、原理 脲酶催化下列反应： 在碱性条件下，碳酸铵与奈氏试剂作用产生橙黄色的碘化双汞铵。在一定范 围内，呈色深浅与碳酸铵量成正比。故可用比色法测定单位时间内酶促反应所产 生的碳酸铵量，从而求得酶促反应速度。 在保持恒定的最适条件下，用相同浓度的脲酶催化不同浓度的尿素发生水合 反应。在一定限度内，酶促反应速度与脲浓度成正比。用双倒数作图法可求得脲 酶的 Km 值。 三、仪器、试剂和材料 1．仪器 （1）试管 16 × 160mm 21 支 （2）吸管 0.5ml×15，lml×1，Zml×1，10ml×1 （3）漏斗 5 个 （4）721 型分光光度计 （5）电热恒温水浴 （6）离心机 （7）康氏振荡机 2．试剂 （1）1／10 mol／L 脲 15.015g，水溶后定容至 250ml。 （2）不同浓度脲液 用 1／10 mol／L 脲稀释成 1／20、1／30、1／ 40、l／50 mol／L 的脲液。 （3）1 ／15 mo／L pH7．0 磷酸盐缓冲液 Na2HPO4 5.969g，水溶后定 容至 250ml。NaH2PO4 2.268g，水溶后定容至 250ml。取 Na2HPO4 溶液 60ml， NaH2PO4 溶液 40ml 混匀，即为 1／15 mol／L pH7.0 磷酸盐缓冲液。 （4）10％硫酸锌 20g ZnSO4 溶于 200ml 蒸馏水中。 （5）0.5 mol／L 氢氧化钠 5g NaOH，水溶后定容至 250ml。 （6）10％酒石酸钾钠 20g 酒石酸钾钠溶于 200ml 蒸馏水中

(7)0.005m0l/L疏酸铵标准液准确称取0.6610g硫酸铵，水溶后 定客至1000ml (8)30%乙髯 60ml95%乙醇，加水130ml,摇匀， (9)奈氏试剂 ①甲8.75gKI溶于50ml水中。 ②乙8.75gK1溶于50ml水中。 ③丙 7.5gHgC12溶于150ml水中 2.5g HgCl 2溶于50ml水中 ⑤甲与丙混合，生成朱红色沉淀。用蒸馏水以倾泻法洗沉淀几次，洗好 后将乙液倒入，令沉淀溶解。然后将丁液逐滴加入，至红色沉淀出现摇动也 不消失为止。定容至250ml。 ⑤称NaOH525g,溶于200ml蒸馏水中，放冷 混合(5)、(6)，并定容至50Oml。上清液转入棕色瓶中。存暗处备用 材 3. 豆粉 四、操作步骤 (1)尿裤提取称大豆粉1g,加30%乙醇25ml,振荡提取1h。4000r/min 离心10min, 上清液备用 (2)取试管5支编号，按下表操作： 3 5 浓度(moL 1201/30 140 1/50160 脲液 加入量(ml) 各05 pH7磷酸缓冲液(m) 各2 37℃保温 5min 加入脲酶(ml) 0.50.5 05 080 並糖酶溶液(m 0 0 0 0 0.5 蒸馏水ml 37℃保温 10 min 加入10%ZNS0(ml) 各0.5 加蒸馏水(ml) 各10 加入0.smo/LaOH(ml) 客0.5 在旋涡振荡器上混匀各管，静置5min后过滤， (3)另取试管5支编号，与上述各管对应，按下表加入试剂(ml): 管号 1 3 4 滤液 各0.5 加蒸馏水(ml) %05 10%酒石酸钾钠ml) 各0.5 0.5molLNaOH (ml) 各0.5 奈氏试剂(ml) 各1

（7）0.005 mol／L 硫酸铵标准液 准确称取 0.6610g 硫酸铵，水溶后 定客至 1000ml。 （8）30％乙醇 60ml 95％乙醇，加水 130ml，摇匀。 （9）奈氏试剂 ①甲 8.75g KI 溶于 50ml 水中。 ②乙 8.75g KI 溶于 50ml 水中。 ③丙 7.5g HgC12 溶于 150ml 水中。 ④丁 2.5g HgC12 溶于 50ml 水中。 ⑤甲与丙混合，生成朱红色沉淀。用蒸馏水以倾泻法洗沉淀几次，洗好 后将乙液倒入，令沉淀溶解。然后将丁液逐滴加入，至红色沉淀出现摇动也 不消失为止。定容至 250ml。 ⑤称 NaOH 52.5g，溶于 200ml 蒸馏水中，放冷。 ①混合（5）、（6），并定容至 500ml。上清液转入棕色瓶中。存暗处备用。 3．材料 大豆粉 四、操作步骤 （1）脲酶提取 称大豆粉 1g，加 30％乙醇 25ml，振荡提取 lh。4000r／min 离心 10min，取上清液备用。 （2）取试管 5 支编号，按下表操作： 管 号 1 2 3 4 5 脲液 浓度（mol/L） 加入量（ml） 1 /20 1/30 1/40 1/50 1/60 各 0.5 pH7 磷酸缓冲液(ml) 各 2 37℃保温 5min 加入脲酶(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0 蔗糖酶溶液(ml) 0 0 0 0 0.5 蒸馏水(ml) 0 0 0 0 1 37℃保温 10 min 加入 10%ZNSO4(ml) 各 0.5 加蒸馏水（ml） 各 10 加入 0.5mol/LnaOH（ml） 各 0.5 在旋涡振荡器上混匀各管，静置 5min 后过滤。 （3）另取试管 5 支编号，与上述各管对应，按下表加入试剂（ml）： 管 号 1 2 3 4 5 滤 液 各 0.5 加蒸馏水（ml） 各 9.5 10%酒石酸钾钠(ml) 各 0.5 0.5mol/LNaOH（ml） 各 0.5 奈氏试剂（ml） 各 1

迅速混匀各管，然后在46Ourn比色，光径1cm。 (4)标准曲线的制作，按下表进行。 管号 12 3 456 0.005mol/L(NH4)2SOa(ml) 00.1 0.2 0.3 0.40.5 加蒸馏水(ml) 10 9.9 9.8 9.7 9.69.5 10%酒石酸钾钠ml) 各0.5 0.5mol/LNaOH (ml) 各0.5 奈氏试剂(ml) 各1 五、结果处理 在标准曲线上查出脲酶作用于不同浓度脲液生成碳酸胺的量，然后取单位时 间生成碳酸铵量的倒数即1/V为纵坐标，以对应的脲液浓度的倒数即1/(S)为 横坐标作双倒数图，求出Km值。 六、注意事项 (1)准确控制各管酶反应时间尽量一致。 (2)按表中顺序加入各种试剂。 (3)奈氏试剂腐蚀性强，勿洒在试管架和实验台面上。 七、思考题 除了双倒数作图法，还有哪些方法可求得Km值？ 参考文献 陈破垄，生物化学研究技术。北京：中国农业出版社，1995 郑洪元，张德生。土壤动态生物化学研究法。北京：科学出版社，1982

迅速混匀各管，然后在 460urn 比色，光径 1cm。 （4）标准曲线的制作，按下表进行。 管 号 1 2 3 4 5 6 0.005mol/L(NH4)2SO4(ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 加蒸馏水（ml） 10 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 10%酒石酸钾钠(ml) 各 0.5 0.5mol/LNaOH（ml） 各 0.5 奈氏试剂（ml） 各 1 五、结果处理 在标准曲线上查出脲酶作用于不同浓度脲液生成碳酸胺的量，然后取单位时 间生成碳酸铵量的倒数即 1／V 为纵坐标，以对应的脲液浓度的倒数即 1/〔S〕为 横坐标作双倒数图，求出 Km 值。 六、注意事项 （1）准确控制各管酶反应时间尽量一致。 （2）按表中顺序加入各种试剂。 （3）奈氏试剂腐蚀性强，勿洒在试管架和实验台面上。 七、思考题 除了双倒数作图法，还有哪些方法可求得 Km 值？ 参考文献 陈破垄，生物化学研究技术。北京：中国农业出版社，1995 郑洪元，张德生。土壤动态生物化学研究法。北京：科学出版社，1982