河南农业大学：《生物化学》课程教学资源（实验指导）实验五 蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离

实验六蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离 一、目的 1.学习水解蛋白质的方法。 2.掌握纸层析的基本技术。 3。学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的方法。 二、原理 1,蛋白质的水解 蛋白质可以用酸、碱或酶如胃蛋白酶，胰蛋白醛，糜蛋白酶水解成最终产物氨基酸。 叭。盐酸溶液中将蛋白质在110加热大约20 ,肽健断裂 质完 解为氨基酸 酸法水解蛋白质的优点是在水解过程中不发生外消旋作用，所得到的氨基酸均为L 氨基酸。大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的，但色氨酸则完全被破坏。丝氨酸和苏氨酸在酸 解过程中或多或少地也有破坏。色氨酸的水解产物已知是一种棕黑色的物质一一腐黑质，因 此，用酸法水解蛋白质得到的水解液为棕黑色的。 2.纸层析法分离氨基酸 纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。它利用不同物质在同一推动剂中具有不同 的分配系数，经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系 数是一个常数，若以K表示分配系数 K=质在流动相中的浓度 层析溶剂（又称推动剂）， 是选用有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲利 力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一般达滤纸 重的22%左右（其中约有6%的水与纤维素结合成复合物），由于这部分水扩散作用降低形 成固定相：而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形 成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品 的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。随着有机溶剂不断向前移 动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，同时溶质离开原点入 断向前移动，溶质中各组分的分配系数不同，前进中出现了移动速率差异，通过一定时间的 层析，不同组分便实现了分离。物质的移动速率以R值表示： 原点到层析点中心的距离 R:=原点到溶剂前沿的距离 各种化合物在恒定条件下，层析后都有其一定的R值，借此可以达到定性、鉴别的目 的。 溶质的结构与极性、溶剂系统的物质组成与比例、pH值、滤纸的质地以及层析的温度、 时间等都会影响R值。 三、仪器试剂和材料 1.仪器 (1)干燥箱 (2)水浴锅

实验六 蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离 一、目的 1．学习水解蛋白质的方法。 2．掌握纸层析的基本技术。 3．学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的方法。 二、原理 1．蛋白质的水解 蛋白质可以用酸、碱或酶如胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶水解成最终产物氨基酸。 实验室中常使用酸解法水解蛋白质。当在 6 mo 叭。盐酸溶液中将蛋白质在 110t 加热大约 20 h，肽键断裂，此时蛋白质完全分解为氨基酸。 酸法水解蛋白质的优点是在水解过程中不发生外消旋作用，所得到的氨基酸均为 L 一 氨基酸。大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的，但色氨酸则完全被破坏。丝氨酸和苏氨酸在酸 解过程中或多或少地也有破坏。色氨酸的水解产物已知是一种棕黑色的物质——腐黑质，因 此，用酸法水解蛋白质得到的水解液为棕黑色的。 2．纸层析法分离氨基酸 纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。它利用不同物质在同一推动剂中具有不同 的分配系数，经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系 数是一个常数，若以 K 表示分配系数 层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和 力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH 基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一般达滤纸 重的 22％左右（其中约有 6％的水与纤维素结合成复合物），由于这部分水扩散作用降低形 成固定相；而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形 成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品 的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。随着有机溶剂不断向前移 动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，同时溶质离开原点不 断向前移动，溶质中各组分的分配系数不同，前进中出现了移动速率差异，通过一定时间的 层析，不同组分便实现了分离。物质的移动速率以 Rf值表示： 各种化合物在恒定条件下，层析后都有其一定的 Rf 值，借此可以达到定性、鉴别的目 的。 溶质的结构与极性、溶剂系统的物质组成与比例、pH 值、滤纸的质地以及层析的温度、 时间等都会影响 Rf值。 三、仪器试剂和材料 1．仪器 （1）干燥箱 （2）水浴锅

(3)安培瓶 (4)层析缸 (5)吹风材 (6)喷雾器 2.试剂 (6mol /IHCI (2)标氨基酸(ml/mL):称取亮氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、组氨酸 洛mg 分别溶 Flml0.01mol/L的HC溶液中，保存于冰箱 (3)展层剂：正丁醇：88%甲酸：水=15：3：2(V/V) (4)0.5%的茚三酮丙酮溶液 (5)10%异丙醇溶液 3.材料 )层析滤纸(I0cm ×10cm),普通滤纸(21cm×21cm (2)毛细管、培养皿、镊子 四、操作步骤 1.蛋白质的水解 称取0.Zg酵母粉，放进一个小安培瓶中，向瓶中加入1ml6mol/L的盐酸，于喷灯 火焰上封口。将安培瓶放入干燥箱内，在10℃下水解20h后，把安培 内的水解液倒进蒸 发皿内，将蒸发皿放于沸水浴上加热以除去水解液中的盐酸。将水解液蒸干，溶解于0.5一」 ml10%的异丙醇中。 2.纸层析法分离氨基酸 取1张10X10m的层析滤纸放在普向法纸上，用直尺和铅笔在距法纸底边2cm处 划一条平行于底边的很轻的直线做为基线。沿直线 一定的间隔做标记以指示标准氨 基酸利 蛋白质水解液的加样位置。用毛细管吸少量氨基酸样品点于标记的位置上。点样时，毛细管 口应与滤纸轻轻接触，样点直径一般控制在0,3m之内。用吹风机稍加吹干后再点下一次， 重复3次，每次的样品点应完全重合。加样完毕后，将滤纸卷成圆筒状，使基线吻合，两边 不搭接，用针和线将纸两边缝合。将点好样品的滤纸移入层析缸中（层析缸内事先加入一个 注人40ml展层剂的直径为10cm的培养皿，使液层厚度为 cm左右，盖上层析缸的盖子 20min,以保证罩内有 定蒸汽压)，采用上行法进行展层。当溶剂前沿上升到距纸上端1cm 时，取出滤纸，立即用铅笔记下溶剂前沿的位置，剪断缝线，用吹风机吹干滤纸上的溶剂。 之后用前三酮丙酮溶液均匀地喷洒在滤纸有效面上，切勿喷得过多致使斑点扩散。然后将滤 纸放入烘箱，于80℃下显色5min后取出。 五、结果处理 用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距 离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的R:值，与标准氨基酸的R:值对照，确定水解液 中含有哪些氨基酸。 六、注意事项 1.点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面（即展层时样品可能达到的部分）。 2.点样斑点不能太大（直径应小于0.3cm),防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠， 且吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。 3.展层开始时切勿使禅品点浸入溶剂中

（3）安培瓶 （4）层析缸 （5）吹风机 （6）喷雾器 2．试剂 （1）6mol／L HCl （2）标准氨基酸（lml／mL）：称取亮氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、组氨酸 各 lmg，分别溶于 lml 0.01mol／L 的 HCl 溶液中，保存于冰箱 （3）展层剂：正丁醇：88％甲酸：水＝15：3：2（V／V） （4）0.5％的茚三酮丙酮溶液 （5）10％异丙醇溶液 3．材料 （1）层析滤纸（10cm × 10cm），普通滤纸（21cm × 21cm） （2）毛细管、培养皿、镊子 四、操作步骤 1．蛋白质的水解 称取 0．Zg 酵母粉，放进一个小安培瓶中，向瓶中加入 l ml 6mol／L 的盐酸，于喷灯 火焰上封口。将安培瓶放入干燥箱内，在 110℃下水解 20 h 后，把安培瓶内的水解液倒进蒸 发皿内，将蒸发皿放于沸水浴上加热以除去水解液中的盐酸。将水解液蒸干，溶解于 0.5—l ml 10％的异丙醇中。 2．纸层析法分离氨基酸 取 1 张 10 × 10cm 的层析滤纸放在普遍滤纸上，用直尺和铅笔在距滤纸底边 2 cm 处 划一条平行于底边的很轻的直线做为基线。沿直线以一定的间隔做标记以指示标准氨基酸和 蛋白质水解液的加样位置。用毛细管吸少量氨基酸样品点于标记的位置上。点样时，毛细管 口应与滤纸轻轻接触，样点直径一般控制在 0.3cm 之内。用吹风机稍加吹干后再点下一次， 重复 3 次，每次的样品点应完全重合。加样完毕后，将滤纸卷成圆筒状，使基线吻合，两边 不搭接，用针和线将纸两边缝合。将点好样品的滤纸移入层析缸中（层析缸内事先加入一个 注人 40ml 展层剂的直径为 10cm 的培养皿，使液层厚度为 1cm 左右，盖上层析缸的盖子 20min，以保证罩内有一定蒸汽压），采用上行法进行展层。当溶剂前沿上升到距纸上端 Icm 时，取出滤纸，立即用铅笔记下溶剂前沿的位置，剪断缝线，用吹风机吹干滤纸上的溶剂。 之后用前三酮丙酮溶液均匀地喷洒在滤纸有效面上，切勿喷得过多致使斑点扩散。然后将滤 纸放入烘箱，于 80℃下显色 5min 后取出。 五、结果处理 用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距 离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的 Rf值，与标准氨基酸的 Rf值对照，确定水解液 中含有哪些氨基酸。 六、注意事项 1．点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面（即展层时样品可能达到的部分）。 2．点样斑点不能太大（直径应小于 0.3 cm），防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠， 且吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。 3．展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中

4.作为展层剂的正丁醇要重新蒸馏，甲酸须用分析纯的。且展层剂要临用前配制，以 免发生酯化，影响层析结果。 5. 果样品中溶质种类较多，且某些溶质在某一溶剂系统中的R值十分接近时，单向 层析分离效果不佳，则可采用双向层析，即将样品点在一方形滤纸的角上，先用一种溶剂系 统展层。滤纸取出干燥后，再将滤纸转90度角，用另一溶剂系统展层。所得图谱分别与这 两种溶剂系统中作的标准物质层析图谱对比，即可对混合物样品中各成分进行鉴定。 七、思考题 【.为什么点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面 2.影响物质移动速率几值的因素有哪些？ 参考文献 文树基。主编基础生物化学实验指导.西安：陕西科学技术出版社，1994

4．作为展层剂的正丁醇要重新蒸馏，甲酸须用分析纯的。且展层剂要临用前配制，以 免发生酯化，影响层析结果。 5．如果样品中溶质种类较多，且某些溶质在某一溶剂系统中的 Rf值十分接近时，单向 层析分离效果不佳，则可采用双向层析，即将样品点在一方形滤纸的角上，先用一种溶剂系 统展层。滤纸取出干燥后，再将滤纸转 90 度角，用另一溶剂系统展层。所得图谱分别与这 两种溶剂系统中作的标准物质层析图谱对比，即可对混合物样品中各成分进行鉴定。 七、思考题 l．为什么点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面？ 2．影响物质移动速率几值的因素有哪些？ 参考文献 文树基。主编基础生物化学实验指导．西安：陕西科学技术出版社，1994