河北农业大学:《基因工程》课程教学课件(PPT讲稿)基因操作的主要技术原理

第二章 基因操作的主要技术原理
第二章 基因操作的主要技术原理

• 核酸的凝胶电泳 • 扩增原理 • 分子杂交 • 测序
• 核酸的凝胶电泳 • 扩增原理 • 分子杂交 • 测序

•核酸的凝胶电泳 它是一种分析鉴定重组DNA分子及 蛋白质与核酸相互作用的重要实验手 段,同时也是分子生物学研究方法的 技术基础
•核酸的凝胶电泳 它是一种分析鉴定重组DNA分子及 蛋白质与核酸相互作用的重要实验手 段,同时也是分子生物学研究方法的 技术基础

• 基本原理 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链, 依靠无反应活性的稳定的介质(琼脂糖 凝胶和聚丙烯酰胺凝胶)和缓冲液,在 电场中以一定的迁移率从负极移向正极。 根据核酸分子大小不同、构型或形状的 差异,以及所带电荷的不同,可以通过 电泳将其混合物中的不同成分彼此分开
• 基本原理 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链, 依靠无反应活性的稳定的介质(琼脂糖 凝胶和聚丙烯酰胺凝胶)和缓冲液,在 电场中以一定的迁移率从负极移向正极。 根据核酸分子大小不同、构型或形状的 差异,以及所带电荷的不同,可以通过 电泳将其混合物中的不同成分彼此分开

• 电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大 小和构型。分子量较小的DNA分子,比 分子量较大的DNA分子迁移率要快;同 等分子量的不同构型的核酸分子,构型 紧密的比松散型的开环DNA分子或线性 DNA分子迁移率要快
• 电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大 小和构型。分子量较小的DNA分子,比 分子量较大的DNA分子迁移率要快;同 等分子量的不同构型的核酸分子,构型 紧密的比松散型的开环DNA分子或线性 DNA分子迁移率要快

• 凝胶电泳的分辨力: 与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.2~50Kb之间; 聚丙烯酰胺的分辨力在1~1000bp之间
• 凝胶电泳的分辨力: 与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.2~50Kb之间; 聚丙烯酰胺的分辨力在1~1000bp之间

•琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的 线性多糖聚合物。 分为常熔点的琼脂糖和低熔点(LMP) 琼脂糖
•琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的 线性多糖聚合物。 分为常熔点的琼脂糖和低熔点(LMP) 琼脂糖

• LMP琼脂糖 熔点:62~65℃ 熔解后,在37℃可保持液态数小时; 在25℃ 可保持液态约10min
• LMP琼脂糖 熔点:62~65℃ 熔解后,在37℃可保持液态数小时; 在25℃ 可保持液态约10min

• 回收DNA分子 在65℃ 下将LMP琼脂糖凝胶熔化; 加入过量的酚抽提DNA; 离心获得含DNA分子的上清液; • 直接酶切
• 回收DNA分子 在65℃ 下将LMP琼脂糖凝胶熔化; 加入过量的酚抽提DNA; 离心获得含DNA分子的上清液; • 直接酶切

• 琼脂糖凝胶电泳的参数: 缓冲液:1× TAE(TBE TPE) 凝胶的含量:根据检测的DNA大小 加DNA样品:<1μg,指示剂 电泳条件:大片断低电压长时间,小片段高电压短 时间 染色和观察:溴化乙锭(ethidium bromide,EB) 染色,在300nm波长的紫外下观察(凝胶成像仪)。 能看到0.05 μg的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比
• 琼脂糖凝胶电泳的参数: 缓冲液:1× TAE(TBE TPE) 凝胶的含量:根据检测的DNA大小 加DNA样品:<1μg,指示剂 电泳条件:大片断低电压长时间,小片段高电压短 时间 染色和观察:溴化乙锭(ethidium bromide,EB) 染色,在300nm波长的紫外下观察(凝胶成像仪)。 能看到0.05 μg的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比
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