《生物技术概论》课程教学课件（PPT讲稿）生物技术概论实验

四川農業大学Sichuan Agricultural University生物技术概论实验余国武

生物技术概论实验 余国武

四川農業大学Sichuan Agricultural Usiversity质粒的提取及PCR阳性克隆的鉴定一、实验目的：掌握生物技术操作的基本原理、方法和操作。二、实验材料和所需的仪器。、三、实验方法和步骤·四、实验结果与分析

质粒的提取及PCR阳性克隆的鉴定 • 一、实验目的：掌握生物技术操作的基本原理、 方法和操作。 • 二、实验材料和所需的仪器。 • 三、实验方法和步骤。 • 四、实验结果与分析

四川農業大学Sichuan Agricultural University：二、实验材料和所需的仪器转入了的T-vector-p53基因的大肠杆菌细胞株、M13引物、LB培养基、Amp、高离心机、摇床、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统三、实验方法和步骤。1.取1～2ml过夜培养的菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清注意：对于低拷贝数的质粒，请用4～6ml菌液，通过多次离心将菌体收集到一个离心管中。2.加入200μISolution1，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。注意：*确认SolutionI中已加入RnaseA*不要残留细小菌块，否则会影响裂解，导致提取量和纯度偏低

• 二、实验材料和所需的仪器 转入了的T-vector-p53基因的大肠杆菌 细胞株、M13引物、LB培养基、Amp、离心机、摇 床、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统。 • 三、实验方法和步骤。 • 1. 取1～2ml过夜培养的菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清。 • 注意：对于低拷贝数的质粒，请用4～6ml菌液，通过多次离心将菌体 收集到一个离心管中。 • 2. 加入200μl Solution Ⅰ，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。 • 注意：* 确认Solution I中已加入RnaseA. • * 不要残留细小菌块，否则会影响裂解，导致提取量和纯度偏低

四川農業大学triculturatUsiversitySiehaa3.加入200μSolutionIl，立即温和并充分地上下翻转混合4～6次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的蛋清状溶液，此步骤不宜超过5min。注意：*SolutionlI使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的co2中和SolutionII中的NaOH发生中和反应，降低溶菌效率。*避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。4.加入350μ1SolutionlⅢl，温和并充分地上下翻转混合8～10次，室温放置2～5min。12，000rpm，离心10min。注意：避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。5.将步骤4中的上清转移到套放于1.5ml收集管，室温12000rpm离心1min，取出上清与新的收集管中。注意：忌取到沉淀，否则会出现基因组DNA和蛋白质污染。6.将2.5倍体积的无水乙醇加到上清中，-20度沉淀30min。7.12000rpm离心10min。75%的乙醇1ml洗涤沉淀1次，无水乙醇1ml洗涤沉淀1次。干燥5min。8.30ul蒸馏水加水溶解。电泳检测

• 3. 加入200μl Solution Ⅱ，立即温和并充分地上下翻转混合4～6 次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的蛋清状溶液，此步骤不宜超过 5min。 • 注意：* Solution II使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和 Solution II中的NaOH发生中和反应，降低溶菌效率。 • * 避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。 • 4. 加入350μl SolutionⅢ，温和并充分地上下翻转混合8～10次 ，室温放置2～5min。12,000rpm，离心10min。 • 注意：避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。 • 5. 将步骤4中的上清转移到套放于1.5ml收集管，室温12000rpm 离 心1min，取出上清与新的收集管中。 • 注意：忌取到沉淀，否则会出现基因组DNA和蛋白质污染。 • 6. 将2.5倍体积的无水乙醇加到上清中，-20度沉淀30min。 • 7.12000rpm离心10min。75%的乙醇1ml洗涤沉淀1次，无水乙醇1ml洗 涤沉淀1次。干燥5min。 • 8. 30ul蒸馏水加水溶解。电泳检测

四川農業大学sickuan AgrieulturalUniversity7．将GenCleanColumn重新放回收集管中，加入500μlWashSolution，12,000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中废液。8．重复步骤7一次。9.倒掉收集管中废液，12,000rpm，室温离心1min，彻底去除WashSolution。注意：此步骤高速空离是为了去尽残留的乙醇，请勿省略，否则可能因所纯化的核酸中残留有乙醇而影响后续的实验效果。将GenClean柱室温开盖放置10min或50℃放置5min，将有助于彻底去除WashSolution中的乙醇。10.将GenCleanColumn放入干净的1.5ml离心管中，在GenCleanColumn膜中央加入50μ1～70μ1EiutionBuffer，37℃放置2min。12,000rpm，室温离心1min，离心管中的液体即为包含自的质粒的溶液，取2～5μI进行琼脂糖凝胶电泳检测，纯化好的DNA可立即用于后续实验或-20℃冻存

• 7. 将GenClean Column重新放回收集管中，加入500μl Wash Solution，12,000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中废液。 • 8. 重复步骤7一次。 • 9. 倒掉收集管中废液，12,000 rpm，室温离心1min，彻底去除Wash Solution。 • 注意：此步骤高速空离是为了去尽残留的乙醇，请勿省略，否则可能 因所纯化的核酸中残留有乙醇而影响后续的实验效果。将GenClean柱 室温开盖放置10min或50℃放置5min，将有助于彻底去除Wash Solution中的乙醇。 • 10. 将GenClean Column放入干净的1.5ml离心管中，在GenClean Column膜中央加入50μl～70μl Elution Buffer，37℃放置2min。 12,000rpm，室温离心1min，离心管中的液体即为包含目的质粒的溶 液，取2～5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，纯化好的DNA可立即用于后 续实验或-20℃冻存

四川農業大学Sichuan Agricultural UniversityPCR鉴定。取1ul蒸馏水稀释10倍，取1ul作为模板，M13作为引物PCR扩增。电泳检测。·四、实验结果与分析。1、质粒抽提的电泳图谱分析，条带是否单一、亮度如何，浓度纯度如何。2、PCR电泳是否有条带，扩增大小是否对，扩增条件是否合适。通过电泳结果分析实验结果

• PCR鉴定。 • 取1ul蒸馏水稀释10倍，取1ul作为模板，M13作为引物PCR 扩增。电泳检测。 • 四、实验结果与分析。 1、质粒抽提的电泳图谱分析，条带是否单一、 亮度如何，浓度纯度如何。 2、PCR电泳是否有条带，扩增大小是否对，扩 增条件是否合适。通过电泳结果分析实验结果