西北大学生命科学学院：《生物化学》课程实验教案（讲义，共十五个实验）

实验室安全教育一、实验目的1.了解实验室安全管理制度2.主要掌握化学品使用、危险废物处置和应急救援二、实验室典型安全隐患及安全教育案例1.试剂瓶放在桌面边缘2.做完实验盖子不及时盖好拧紧3.废液桶与废弃物存放点无警戒标识4.典型事故、事例8·12天津滨海新区爆炸事故一一高校实验室安全管理的分水岭；2015年8月12日，天津市滨海新区发生火灾爆炸事故造成165人遇难、8人失踪，798人受伤，造成直接经济损失68.66亿元。瑞海公司集装箱内的硝化棉在高温等因素的作用下自燃，引起相邻集装箱内的硝酸铵等危险化学品发生爆炸。8月14日国务院紧急出台《关于深入开展危险化学品和易燃易爆物品安全专项整治的紧急通知》三、一般安全1.应熟悉实验室环境：水、电阀门以及安全通道的位置。熟悉各类灭火和应急设备的位置和使用方法。2.开展实验时要密切关注实验进展情况，不得擅自离岗，进行危险实验时至少2人在场。严禁将实验室内任何物品私自带出实验室。3.实验结束后，最后一个离开实验室的人员必须检查并关闭整个实验室的水、电、气、门窗。4.进入实验室要做好必要的个人防护，不得在实验室内穿露脚趾的鞋子。5.严禁穿着实验室防护服离开实验室，如就餐或去办公室、休息室和卫生间等。6.禁止在实验室工作区域进食、饮水、吸烟、化妆和处理隐形眼镜。7.禁止在实验室储存食品和饮料。8.处理感染性实验材料和动物后，以及离开实验室前都应洗手。9.实验室内用过的防护服不得和日常服装放在同一柜子内

实验室安全教育 一、实验目的 1. 了解实验室安全管理制度 2. 主要掌握化学品使用、危险废物处置和应急救援 二、实验室典型安全隐患及安全教育案例 1. 试剂瓶放在桌面边缘 2. 做完实验盖子不及时盖好拧紧 3. 废液桶与废弃物存放点无警戒标识 4. 典型事故、事例 8·12 天津滨海新区爆炸事故——高校实验室安全管理的分水岭；2015 年 8 月 12 日，天津市滨海新区发生火灾爆炸事故造成 165 人遇难 、 8 人失踪， 798 人受伤 ，造成直接经济损失 68.66 亿元。瑞海公司集装箱内的硝化棉在高温等 因素的作用下自燃， 引起相邻集装箱内的硝酸铵等危险化学品发生爆炸。 8 月 14 日国务院紧急出台《关于深入开展危险化学品和易燃易爆物品安全专 项整治的紧急通知》 三、一般安全 1. 应熟悉实验室环境： 水、 电阀门以及安全通道的位置。 熟悉各类灭火和 应急设备的位置和使用方法。 2. 开展实验时要密切关注实验进展情况， 不得擅自离岗，进行危险实验时至 少 2 人在场。 严禁将实验室内任何物品私自带出实验室。 3. 实验结束后， 最后一个离开实验室的人员必须检查并关闭整个实验室的 水、 电、 气、 门窗。 4. 进入实验室要做好必要的个人防护， 不得在实验室内穿露脚趾的鞋子。 5. 严禁穿着实验室防护服离开实验室， 如就餐或去办公室、休息室和卫生间 等。 6. 禁止在实验室工作区域进食、 饮水、 吸烟、 化妆和处理隐形眼镜。 7. 禁止在实验室储存食品和饮料。 8. 处理感染性实验材料和动物后， 以及离开实验室前都应洗手。 9. 实验室内用过的防护服不得和日常服装放在同一柜子内

四、消防安全1.实验室火灾隐患1）加热设备引起火灾2）违反操作规程引起火灾不规范的蒸馏、回流等操作3）易燃易爆危险品引起火灾4）化学废弃物易引起火灾5）用电不规范或电路老化引起火灾6）违规吸烟，乱扔烟头引起火灾2.火灾初起的紧急处理3.消防器材使用方法4.火场自救与逃生常识生命安全最重要！五、化学品安全1.危险化学品是指具有毒害、腐蚀、爆炸、燃烧、助燃等性质，对人体、环境具有危害的剧毒化学品和其他化学品。2.采购受公安机关管控，应通过院系申请、学校等相关部门审批，由管理人员登录“危险化学品治安管理信息系统”进行网上备案，获得公安机关审批后，统一采购。3.化学品保存的一般原则：保持整洁、通风、隔热、安全，远离热源、火源、电源和水源，避免阳光直射。4.危险品分类存放要求：如还原剂、有机物等不能与氧化剂、硫酸、硝酸混放；5.强酸不能与强氧化剂的盐类混放；6.遇酸可产生有害气体的盐类（如：氰化钾等）不能与酸混放。六、化学品使用规范1.进行实验之前应先阅读使用化学品的安全技术说明书，了解化学品特性、影响因素与正确处理事故的方法，采取必要的防护措施。2.实验人员穿看适合的实验工作服，长衣长裤，不得穿短裤短裙以及露趾凉鞋。3.严格按实验规程进行操作，在能够达到实验目的和效果的前提下，尽量减少药品用量，或者用危险性低的药品替代危险性高的药品

四、消防安全 1.实验室火灾隐患 1) 加热设备引起火灾 2) 违反操作规程引起火灾 不规范的蒸馏、 回流等操作 3) 易燃易爆危险品引起火灾 4) 化学废弃物易引起火灾 5) 用电不规范或电路老化引起火灾 6) 违规吸烟， 乱扔烟头引起火灾 2. 火灾初起的紧急处理 3. 消防器材使用方法 4. 火场自救与逃生常识 生命安全最重要 ！ 五、化学品安全 1. 危险化学品是指具有毒害、腐蚀、爆炸、燃烧、助燃等性质，对人体、环 境具有危害的剧毒化学品和其他化学品。 2. 采购受公安机关管控， 应通过院系申请、 学校等相关部门审批， 由管理 人员登录“危险化学品治安管理信息系统” 进行网上备案， 获得公安机关审批 后， 统一采购。 3. 化学品保存的一般原则：保持整洁、 通风、 隔热、 安全， 远离热源、 火 源、 电源和水源， 避免阳光直射。 4. 危险品分类存放要求 ：如还原剂、 有机物等不能与氧化剂、硫酸、 硝酸 混放； 5. 强酸不能与强氧化剂的盐类混放； 6. 遇酸可产生有害气体的盐类（如： 氰化钾等）不能与酸混放。 六、化学品使用规范 1. 进行实验之前应先阅读使用化学品的安全技术说明书，了解化学品特性、 影响因素与正确处理事故的方法，采取必要的防护措施。 2.实验人员穿着适合的实验工作服，长衣长裤，不得穿短裤短裙以及露趾凉鞋。 3.严格按实验规程进行操作，在能够达到实验目的和效果的前提下，尽量减少 药品用量，或者用危险性低的药品替代危险性高的药品

4.不可直接接触药品、品尝药品味道、把鼻子凑到容器口嗅闻药品的气味。5.使用剧毒化学品、爆炸性物品或强挥发性、刺激性、恶臭化学品时，应在通风良好的条件下进行。七、危险废物处置：1.破损的玻璃仪器（试管、量筒、烧杯等）应专门存放，不得与实验垃圾混放。2.废试剂瓶倒尽残液后应使用专用纸箱包装存放。3.化学实验废液不得直接倒入下水道。液桶盛放不得超过最大容量的80%。收集废液后应随时盖紧盖子（含内盖），存放位置要阴凉并远离热源、火源。4.运送实验废物时，至少需两人同行，并穿着实验服，佩戴口罩和手套，做好防护。配合管理人员检查并称重，填写入库记录，粘贴危险废物标签。八、应急救援：发生化学安全事故，应立即报告老师，并积极采取措施进行应急救援，然后送医院治疗。1.化学烧灼伤应立即脱去沾染化学品的衣物，迅速用大量清水长时间冲洗，避免扩大烧伤面。处理时，应尽可能保持水疱皮的完整性，不要撕去受损的皮肤。2.化学冻伤应迅速脱离低温环境和冰冻物体，用40℃左右温水将冰冻融化后将衣物脱下或剪开，然后对冻伤部位进行复温，并尽快就医。3.吸入化学品中毒果断措施切断毒源，并打开门、窗，降低毒物浓度。迅速将伤员救离现场搬至空气新鲜、流通的地方，松开领口、紧身衣服和腰带，以利呼吸畅通，使毒物尽快排出

4.不可直接接触药品、品尝药品味道、把鼻子凑到容器口嗅闻药品的气味。 5.使用剧毒化学品、 爆炸性物品或强挥发性、 刺激性、 恶臭化学品时， 应 在通风良好的条件下进行。 七、危险废物处置: 1.破损的玻璃仪器（试管、量筒、烧杯等）应专门存放，不得与实验垃圾混放。 2.废试剂瓶倒尽残液后应使用专用纸箱包装存放。 3.化学实验废液不得直接倒入下水道。液桶盛放不得超过最大容量的 80%。收 集废液后应随时盖紧盖子（含内盖），存放位置要阴凉并远离热源、 火源。 4.运送实验废物时， 至少需两人同行， 并穿着实验服， 佩戴口罩和手套， 做 好防护。 配合管理人员检查并称重， 填写入库记录， 粘贴危险废物标签。 八、应急救援： 发生化学安全事故， 应立即报告老师， 并积极采取措施进行应急救援， 然 后送医院治疗。 1.化学烧灼伤 应立即脱去沾染化学品的衣物，迅速用大量清水长时间冲洗，避免扩大烧伤 面。处理时，应尽可能保持水疱皮的完整性，不要撕去受损的皮肤。 2.化学冻伤 应迅速脱离低温环境和冰冻物体，用 40℃左右温水将冰冻融化后将衣物脱 下或剪开，然后对冻伤部位进行复温，并尽快就医。 3.吸入化学品中毒 果断措施切断毒源，并打开门、 窗， 降低毒物浓度。迅速将伤员救离现场， 搬至空气新鲜、 流通的地方，松开领口、 紧身衣服和腰带， 以利呼吸畅 通， 使毒物尽快排出。

上学期实验：实验一蛋白质浓度的测定(1)一一Folin-酚法一、实验目的1.学习Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及方法2.学习绘制标准曲线3.掌握用标准曲线求待测物质含量的方法二、实验原理1921年，Folin首创，利用蛋白质分子中酪氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应。1951年，Lowry对此法进行了改进，先在标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸(Tyr），故有此显色反应。该反应分两步进行，首先在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质-Cu2+复合物，然后，蛋白质-Cu2+复合物中所含的酪氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故可根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。三、实验试剂及仪器1.实验试剂（1）待测样品（2）酪蛋白标准品（3）Folin-酚试剂甲：（4）Folin-酚试剂乙：（5）酪蛋白标准溶液母液（500μg/ml）：2.实验仪器（1）722N型可见分光光度计（2）试管7支、试管架（3）移液枪（4）水浴锅

上学期实验： 实验一 蛋白质浓度的测定(1)—— Folin-酚法 一、实验目的 1. 学习 Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及方法 2. 学习绘制标准曲线 3. 掌握用标准曲线求待测物质含量的方法 二、实验原理 1921 年，Folin 首创，利用蛋白质分子中酪氨酸残基（酚基）还原酚试剂 （磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应。1951 年，Lowry 对此法进行了改进，先在标本 中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。 Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合 物还原而呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪 氨酸(Tyr) ，故有此显色反应。该反应分两步进行，首先在碱性溶液中，蛋白质 分子中的肽键与碱性铜试剂中的 Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物，然 后，蛋白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸， 生成蓝色的化合物。 在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故可根据预先 绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。 三、实验试剂及仪器 1. 实验试剂 （1） 待测样品 （2） 酪蛋白标准品 （3）Folin-酚试剂甲： （4）Folin-酚试剂乙： （5）酪蛋白标准溶液母液（500μ g/ml）： 2. 实验仪器 （1）722N 型可见分光光度计 （2）试管 7 支、试管架 （3）移液枪 （4）水浴锅

四、实验步骤1、标准曲线的绘制：编号酪蛋白标准去离子水Folin-酚甲Folin-酚乙A500(标准溶液溶液母液(ml)(ml)(ml)浓度)(500μ g/ml)ml10.01.05.00.50.00020.20.85.00.5X.XXX30.45.00.50.6X.XXX40.60.45.00.5X.XXX50.80.25.00.5X.xxX61.00.05.00.5X.XXX待测样液7(2)0.55.00.5X.XXX0.5ml取六支干净试管编号，按下表加入试剂：（单位毫升）2.待测样品：准确吸取待测样液0.5ml于7号试管内，加入蒸馏水0.5ml、Folin-试剂甲5.0ml、Folin-试剂乙0.5ml，重复上步操作，测样品A500。五、实验结果与分析1.标准曲线绘制AAA,-A.--1-1-A.1111C4CC6CC2CC0XCx：为根据待测样品的吸光值查标准曲线所得的蛋白质浓度

四、实验步骤 1、标准曲线的绘制： 取六支干净试管编号，按下表加入试剂：（单位毫升） 2. 待测样品： 准确吸取待测样液 0.5ml 于 7 号试管内，加入蒸馏水 0.5ml、Folin-试剂甲 5.0ml、Folin-试剂乙 0.5ml，重复上步操作，测样品 A500。 五、实验结果与分析 1. 标准曲线绘制 CX ：为根据待测样品的吸光值查标准曲线所得的蛋白质浓度 编号 (标准溶液 浓度) 酪蛋白标准 溶液母液 (500μ g/ml) ml 去离子水 (ml) Folin-酚甲 (ml) Folin-酚乙 (ml) A500 1 0.0 1.0 5.0 0.5 0.000 2 0.2 0.8 5.0 0.5 X.XXX 3 0.4 0.6 5.0 0.5 X.XXX 4 0.6 0.4 5.0 0.5 X.XXX 5 0.8 0.2 5.0 0.5 X.XXX 6 1.0 0.0 5.0 0.5 X.XXX 7(?) 待测样液 0.5ml 0.5 5.0 0.5 X.XXX

2.计算待测样品浓度根据图中数值，计算出待测样品的浓度。六、实验注意事项（一）实验操作注意事项1.Folin-酚乙试剂在碱性条件下不稳定，当Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中后，必须立即混匀（加一管混匀一管），使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前：2.尽量减少各管之间的反应时间误差；3.一定要注意实验的时间，因为溶液的光密度值是随着时间在不断增大的，如果时间超过了30分钟，则测得的光密度值就不准确了；4.在使用分光光度计时，拿比色血是要拿它的毛面，不可以用手接触它的光滑面，防止自己手上的油污是测量值不准确5.在擦拭比色血时，要顺着一个方向擦；6.在比色血中装入的液体量大约要是比色皿体积的三分之二（二）标准曲线制作注意事项1.作一条标准曲线至少要5个点2.被测物与标准物应在相同条件下测定3.尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲线或直线两侧4.标准曲线中标准物浓度有一定的线性范围，应使标准曲线范围在被测物质浓度的1/2～2倍之间，并使吸光度在0.05～1.0范围为宜（三）移液枪使用注意事项1.量程选择：35%-100%范围内最佳2.大体积一小体积顺时针：小体积一→大体积逆时针3将移液枪端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可4.吸液：垂直吸液，枪头尖端需浸入液面2-4mm以下。慢吸慢放，控制好弹簧的伸缩速度。吸液速度太快会产生反冲和气泡，导致移液体积不准确。5.放液：将吸嘴口贴到容器内壁并保持10-40°倾斜。平稳地把按钮压到一档，停约一秒钟后压到二档，排出剩余液体。压住按钮，同时提起移液枪，松开按钮。按弹射器除去移液嘴。6.使用完毕：至最大量程，让弹簧恢复原形，挂至移液枪架上

2. 计算待测样品浓度 根据图中数值，计算出待测样品的浓度。 六、实验注意事项 （一）实验操作注意事项 1. Folin-酚乙试剂在碱性条件下不稳定，当 Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶 液中后，必须立即混匀（加一管混匀一管），使还原反应发生在磷钼酸-磷钨 酸试剂被破坏之前; 2. 尽量减少各管之间的反应时间误差； 3. 一定要注意实验的时间，因为溶液的光密度值是随着时间在不断增大的，如 果时间超过了 30 分钟，则测得的光密度值就不准确了； 4. 在使用分光光度计时，拿比色皿是要拿它的毛面，不可以用手接触它的光滑 面，防止自己手上的油污是测量值不准确； 5. 在擦拭比色皿时，要顺着一个方向擦； 6. 在比色皿中装入的液体量大约要是比色皿体积的三分之二. （二）标准曲线制作注意事项 1. 作一条标准曲线至少要 5 个点 2. 被测物与标准物应在相同条件下测定 3. 尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲线或直线两侧 4. 标准曲线中标准物浓度有一定的线性范围，应使标准曲线范围在被测物质浓 度的 1/2～2 倍之间，并使吸光度在 0.05～1.0 范围为宜 （三）移液枪使用注意事项 1. 量程选择：35%-100%范围内最佳 2. 大体积→小体积 顺时针; 小体积→大体积 逆时针 3. 将移液枪端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可 4. 吸液: 垂直吸液，枪头尖端需浸入液面 2-4mm 以下。慢吸慢放，控制好弹 簧的伸缩速度。吸液速度太快会产生反冲和气泡，导致移液体积不准确。 5. 放液: 将吸嘴口贴到容器内壁并保持 10-40°倾斜。平稳地把按钮压到一档， 停约一秒钟后压到二档，排出剩余液体。压住按钮，同时提起移液枪;松开 按钮。 按弹射器除去移液嘴。 6. 使用完毕: 至最大量程, 让弹簧恢复原形，挂至移液枪架上

七、思考题1.试述Folin-酚试剂法的优点？2.应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何注意？3.什么叫标准曲线？绘制标准曲线有何实用意义？实验二蛋白质浓度测定（2）-紫外线（UV）吸收法一、实验目的1.学习紫外线（UV）吸收法测定蛋白质含量的原理2.了解紫外分光光度计的构造原理3.掌握它的使用方法。二、实验原理由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但可作为初步定量的依据。三、实验试剂及仪器1.实验试剂（1）标准蛋白质溶液（1mg/ml）（2）待测蛋白质溶液，浓度需稀释至1mg/ml附近。2.实验仪器紫外分光光度计、微量移液器、枪头、试管和试管架等四、实验步骤1.标准曲线法：取8支试管，按下表加入试剂（单位ml），并进行操作，绘制标准曲线

七、思考题 1. 试述 Folin-酚试剂法的优点？ 2. 应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何注意？ 3. 什么叫标准曲线？ 绘制标准曲线有何实用意义？ 实验二 蛋白质浓度测定(2)-紫外线（UV）吸收法 一、实验目的 1. 学习紫外线（UV）吸收法测定蛋白质含量的原理 2. 了解紫外分光光度计的构造原理 3. 掌握它的使用方法。 二、实验原理 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具 有吸收紫外线的性质，吸收高峰在 280nm 波长处。在此波长范围内，蛋白质溶 液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。 利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓 度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中） 广泛应用。 此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差 异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的 物质，会出现较大的干扰。 不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即 使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但可作为初步定量的依据。 三、实验试剂及仪器 1. 实验试剂 （1）标准蛋白质溶液（1mg/ml） （2）待测蛋白质溶液，浓度需稀释至 1mg/ml 附近。 2. 实验仪器 紫外分光光度计、微量移液器、枪头、试管和试管架等 四、实验步骤 1. 标准曲线法： 取 8 支试管，按下表加入试剂（单位 ml），并进行操作，绘制标准曲线

A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标（蛋白质浓度为mg/ml)。243a50管号1440607e840.53. 0标准蛋白质溶液。p0.0m1.01.52.54.04样液2.0蒸馏水4.003.5k3.02.52. 01.51. 00.00Oe?4蛋白质浓度0.1250.2500.3750.6250.7501. 004K44t4Aarirt2.取待测蛋白质溶液2.0ml于5号试管中，加入蒸馏水2.0ml，摇匀，按上述方法测定A280，在标准曲线上查出待测蛋白质浓度。五、实验结果与分析1.原始数据：记录各管的OD值2.绘制出标准曲线：要求规范作图（1）用铅笔作图、（2）标出横、纵坐标名称及单位（3）标出日期、作者、曲线名称（4）曲线上体现出待测样品的OD值及浓度值。3.计算：蛋白质含量。（1）要求：写出公式、代入数据、写出结果。(2）根据标准曲线R2值判断实验结果是否可靠，分析可能造成实验误差的原因有哪些？六、实验注意事项1.比色血使用时注意不要沾污或将比色血的透光面磨损，应手持比色血的毛面。2.待测液制备好后应尽快测量，避免有色物质分解，影响测量结果。3.测得的吸光度A最好控制在0.2~0.8之间，超过1.0时要做适当稀释。4.开关试样室盖时动作要轻缓。5.不要在仪器上方倾倒测试样品，以免样品污染仪器表面，损坏仪器。6.比色血在盛装样品前，应用所盛装样品冲洗两次，测量结束后比色皿应用蒸馏水清洗干净后倒置晾干。若比色皿内有颜色挂壁，可用无水乙醇浸泡清洗。七、思考题1.紫外吸收法与Folin-酚比色法测定蛋白质含量相比，有何缺点及优点？

A280 值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标（蛋白质浓度为 mg/ml）。 2. 取待测蛋白质溶液 2.0 ml 于 5 号试管中,加入蒸馏水 2.0 ml，摇匀，按上述方 法测定 A280，在标准曲线上查出待测蛋白质浓度。 五、实验结果与分析 1． 原始数据:记录各管的 OD 值 2． 绘制出标准曲线：要求规范作图 （1）用铅笔作图、 （2）标出横、纵坐标名称及单位 （3）标出日期、作者 、曲线名称 （4）曲线上体现出待测样品的 OD 值及浓度值。 3. 计算：蛋白质含量。 （1）要求： 写出公式、代入数据、写出结果。 (2）根据标准曲线 R 2 值判断实验结果是否可靠，分析可能造成实验误差 的原因有哪些？ 六、实验注意事项 1. 比色皿使用时注意不要沾污或将比色皿的透光面磨损，应手持比色皿的毛 面。 2. 待测液制备好后应尽快测量，避免有色物质分解，影响测量结果。 3. 测得的吸光度 A 最好控制在 0.2~0.8 之间，超过 1.0 时要做适当稀释。 4. 开关试样室盖时动作要轻缓。 5. 不要在仪器上方倾倒测试样品，以免样品污染仪器表面，损坏仪器。 6. 比色皿在盛装样品前，应用所盛装样品冲洗两次，测量结束后比色皿应用 蒸馏水清洗干净后倒置晾干。若比色皿内有颜色挂壁，可用无水乙醇浸泡 清洗。 七、思考题 1. 紫外吸收法与 Folin-酚比色法测定蛋白质含量相比，有何缺点及优点？

2.若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？3.分析实验误差产生的原因4.为什么吸光度A最好控制在0.2~0.8之间？实验三血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳一、实验目的1.了解电泳的一般原理2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术3.掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的方法二、实验原理血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。血清中含有清蛋白，α-球蛋白、β-球蛋白、Y-球蛋白和各种脂蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同，因此可以将它们分离。在相同碱性PH值缓冲体系中，分子量小、等电点低、带负荷电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度较快。醋酸纤维素薄膜电泳是采用醋酸纤维素薄膜作为支持物的一种电泳方法。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，该膜具有均一的泡沫状结构，厚度约为120um，通透性好，对分子移动阻力少，是一种良好的电泳支持物。具有微量、快速、简便、区带清晰、灵敏度高、便于摄影和保存等优点。常用于科学实验、生化产品分析和临床化验，如血浆蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、同工酶等的分离鉴定。三、实验试剂及仪器1.实验试剂、材料巴比妥-巴比妥钠缓冲溶液，染色液，漂洗液，血清：医院采血2.实验仪器常压电泳仪、水平电泳槽、点样器、滤纸、醋酸纤维素薄膜、培养血、镊子等四、实验步骤1.准备和点样：将醋酸纤维素薄膜（2cmX8cm）浸入缓冲溶液中，待完全浸透用镊子轻轻

2. 若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？ 3. 分析实验误差产生的原因 4. 为什么吸光度 A 最好控制在 0.2~0.8 之间？ 实验三 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 一、实验目的 1. 了解电泳的一般原理 2. 掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术 3. 掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的方法 二、实验原理 血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于 pH7.4。它们在 pH8.6 的缓冲 液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。 血清中含有清蛋白，α -球蛋白、 β -球蛋白、γ -球蛋白和各种脂蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构 象、分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速 度也不同，因此可以将它们分离。 在相同碱性 PH 值缓冲体系中， 分子量小、 等电点低、带负荷电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度较快。 醋酸纤维素薄膜电泳是采用醋酸纤维素薄膜作为支持物的一种电泳方法。 醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，该膜具有均一的泡 沫状结构，厚度约为 120μ m，通透性好，对分子移动阻力少，是一种良好的 电泳支持物。具有微量、快速、简便、区带清晰、灵敏度高、便于摄影和保存 等优点。常用于科学实验、生化产品分析和临床化验，如血浆蛋白、血红蛋白、 球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、同工酶等的分离鉴定。 三、实验试剂及仪器 1. 实验试剂、材料 巴比妥-巴比妥钠缓冲溶液，染色液，漂洗液，血清:医院采血 2. 实验仪器 常压电泳仪、水平电泳槽、点样器、滤纸、醋酸纤维素薄膜、培养皿、镊子等 四、实验步骤 1. 准备和点样 ： 将醋酸纤维素薄膜（2cm×8cm）浸入缓冲溶液中，待完全浸透用镊子轻轻

取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后将无光泽面朝上平放于滤纸上。点样器在血清上蘸一下，再将点样器轻印在加样线上，使血清成一条状点于醋酸纤维素薄膜一端1.5厘米处，将薄膜无光泽面朝下，点样端为阴极，进行电泳。8cm个点样线(粗面）2cm点样区+1.5cm2.电泳条件：电压80-90V，恒压，1h，电流与薄膜多少相关。3.染色、漂洗：电泳完毕，将薄膜浸于染色液中10分钟，取出，置漂洗液中漂洗2-3次至背景无色，再浸于蒸馏水中观察。五、实验结果与分析以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在PH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为α1-、α2-、β-及Y-球蛋白，如下图所示。电泳方向+Aα2α1βy血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱对照各自电泳结果，分析各将条带是否成功分离，存在的问题及原因有哪些？六、实验注意事项1.薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。2.应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。3.分清薄膜的点样面，点样应点在薄膜的毛面上。4．点样要细窄、均匀、集中；点样量要适量，不宜过多或过少；动作要轻、稳，用力不能太大

取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后将无光泽面朝上平放于滤纸 上。点样器在血清上蘸一下，再将点样器轻印在加样线上，使血清成一条状点 于醋酸纤维素薄膜一端 1.5 厘米处，将薄膜无光泽面朝下，点样端为阴极，进 行电泳。 2. 电泳条件： 电压 80-90V，恒压，1h，电流与薄膜多少相关。 3. 染色、漂洗： 电泳完毕，将薄膜浸于染色液中 10 分钟，取出，置漂洗液中漂洗 2-3 次至 背景无色，再浸于蒸馏水中观察。 五、实验结果与分析 以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在 PH8.6 的缓冲体系中电泳 1h 左 右，染色后可显示 5 条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为α 1-、α 2-、β -及 γ -球蛋白，如下图所示。 对照各自电泳结果，分析各将条带是否成功分离，存在的问题及原因有哪些？ 六、实验注意事项 1 .薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 2. 应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。 3. 分清薄膜的点样面，点样应点在薄膜的毛面上。 4. 点样要细窄、均匀、集中；点样量要适量，不宜过多或过少； 动作要轻、 稳，用力不能太大