《分子生物学与基因工程》课程教学课件（讲稿）第十三章 Recombinant DNA transform into cells

第十三章 重组DNA导入受体细胞ROSS一|重组DNA导入受体细胞的基本策略重组体DNA分子的转化或转染S三I植物细胞的转基因方法S 四 哺乳动物的转基因方法

第十三章 重组DNA导入受体细胞 § 一  重组DNA导入受体细胞的基本策略 § 二  重组体DNA分子的转化或转染 § 三  植物细胞的转基因方法 § 四  哺乳动物的转基因方法

吉祥重组DNA导入受体细胞的基本策略1 流程1ES|载体DNA的分离纯化S目的基因与载体的连接主要是依赖于核酸内切限制酶和DNA连接酶的作用-重组体向宿主细胞的导入11转将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化、福染、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。1

一  重组DNA导入受体细胞的基本策略 1 流程 § 载体DNA的分离纯化 § 目的基因与载体的连接 主要是依赖于核酸内切限制酶和DNA连接酶的作用 § 重组体向宿主细胞的导入 将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化、转 染、显微注射和电穿孔等多种不同的方式

吉12. 导入目的（1）克隆扩增：rDNA导入宿主细胞，利用宿主的生理条件，克隆扩增，克隆片段随着载体（如质粒）“起扩增获得扩增DNA片段（如细菌分裂繁殖）。（2）克隆表达：利用宿主的生理条件，生产基因工程产品或开展基因治疗。受体细胞：接受rDNA分子的细胞称作受体细胞或宿主细胞。有2种既可以复制扩增，也可以基因表达S原核细胞s真核细胞、一般只用作基因表达系统。1招蒙41

2. 导入目的 （1）克隆扩增：rDNA导入宿主细胞，利用宿主的 生理条件，克隆扩增，克隆片段随着载体（如质粒）一 起扩增获得扩增DNA片段（如细菌分裂繁殖）。 （2）克隆表达：利用宿主的生理条件，生产基因工 程产品或开展基因治疗。 受体细胞：接受rDNA分子的细胞称作受体细胞或宿主 细胞。有2种 §原核细胞 既可以复制扩增，也可以基因表达。 §真核细胞 一般只用作基因表达系统

11111111/1111111Prokaryotic hosts111111111111I11ES E.coli：包涵体蛋白1111拉11sBacillus（芽孢杆菌）工程菌11S Streptomyces（链霉菌）：抗生素基因，生物合成基因11111SPseudomonas（假单孢菌）：工程菌SB.Subtilis（枯草杆菌）：分泌型表达1111111E1111111

Prokaryotic hosts § E.coli：包涵体蛋白 § Bacillus（芽孢杆菌）工程菌 § Streptomyces（链霉菌）：抗生素基因，生物 合成基因 § Pseudomonas（假单孢菌）：工程菌 § B.Subtilis (枯草杆菌 )：分泌型表达

111.11/1111111111111111Eukaryotic hosts1/111111111111E1E-（酿酒酵母）§ Saccharomyces cerevisiaes Plants：双子叶植物11肿SAnimals：多用于抗体生产。生殖细胞，大瘤细胞(HeLa细胞)111111111111111111[111111111/11111111111

Eukaryotic hosts § Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母） § Plants：双子叶植物 § Animals：多用于抗体生产。生殖细胞，肿 瘤细胞(HeLa细胞)

1Types of host cell usedfor111gentic engineering111TypeExamplesMajor groupE. coliBacteriaProkaryoticGram+Gram一B.Subtilis（枯草杆菌）FungiMicrobialS. cerevisiaeEukaryoticFilamentousA.Nidulans（构巢曲霉2PlantsEukaryoticVarious typesProtoplastsIntact cellsVarious typesVarious typesWhole organismAnimalsInsect cellsVarious typesEukaryoticMammalian cellsVarious typesOocytesVarious typesWhole organismVarious types

Types of host cell used for gentic engineering Major group Type Examples Bacteria Prokaryotic Gram+ Gram－ E.coli B.Subtilis (枯草杆 菌 ) Fungi Eukaryotic Microbial Filamentous S.cerevisiae A.Nidulans(构巢曲霉 ) Plants Eukaryotic Protoplasts Intact cells Whole organism Various types Various types Various types Animals Eukaryotic Insect cells Mammalian cells Oocytes Whole organism Various types Various types Various types Various types

二 重组体DNA分子的转化或转染V①转化（transformation）：适合质粒（plasmid)作载体；E②转染（transfection)：适合噬菌体作载体：③转导（transduction）：适合噬菌体作载体：④脂质体-介导(liposome-mediated)基因转移；1③微注射(microinjection)：适合真核细胞;③电穿孔（electroporation)法：适合真核细胞

二 重组体DNA分子的转化或转染 ①转化(transformation):适合质粒(plasmid) 作载体; ②转染(transfection):适合噬菌体作载体; ③转导(transduction):适合噬菌体作载体; ④脂质体-介导(liposome-mediated)基因转 移; ⑤微注射(microinjection):适合真核细胞; ⑥电穿孔(electroporation)法:适合真核细胞 ; ⑦基因枪(biolistics,gene gun):适合植物细 胞;

票DNA-coatedProjectiletungstengunInjectionTransformation1Virus麺Transgene福

吉1111S细胞穿透肽（cellHIVTAT1permeatespenetrating peptides,membraneCPPs）：1型人免疫缺陷病毒转录激活因子TAT（HIVHIVTATentersthroughan-1TAT）是第一个被发现的1inducedpore11细胞穿透肽。888111HIVTAT interacts with cytoskeletonS包括小分子化合物、染料、11（PNA)多肽、多肽核酸A：倒置胶粒模型（invertedmicelle蛋白质、质粒DNA、siRNA、mode1），CPPs通过细胞膜上磷脂分子的移动形成倒置胶粒结构，而进入胞浆。200nm的脂质体、噬菌体颗B：直接穿透，即孔隙结构模型（pore粒和超顺磁性粒子等。formationmodel)，CPPs在细胞膜上组成跨1膜的孔隙结构而进入胞浆。11111C：内吞方式进行细胞摄取。111111

§ 细胞穿透肽（cell  penetrating peptides， CPPs）：1型人免疫缺陷病 毒转录激活因子TAT（HIV -1 TAT）是第一个被发现的 细胞穿透肽 。 § 包括小分子化合物、染料、 多肽、多肽核酸（PNA）、 蛋白质、质粒DNA、siRNA、 200nm的脂质体、噬菌体颗 粒和超顺磁性粒子等。 A: 倒置胶粒模型（inverted micelle model），CPPs通过细胞膜上磷脂分子的移 动形成倒置胶粒结构，而进入胞浆。 B: 直接穿透，即孔隙结构模型 (pore formation model)，CPPs在细胞膜上组成跨 膜的孔隙结构而进入胞浆 。 C: 内吞方式进行细胞摄取

肽核酸PNA)(peptide nucleic acids,S以中性了DNA中的戊B糖磷酸NA可以通过CO2HA或RNA序列Watson-形成稳NHBOCPNADNAPNAPNA:DNAtcypTriplexQuadruplexDuplex3'-endH,N-R戊糖磷酸二酯键肽链酰胺2-氨基N乙基甘氨酸键0HNCRepeatunitO=P-HNBThymineCytosineO=P-UAdenineORHNRGuanine生物通ONAPNAOCONHProteinPNADNA5'-endC-terminus

肽核酸（peptide nucleic acids，PNA） § 以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊 糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过 Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列， 形成稳定的双螺旋结构