《分子生物学与基因工程》课程教学课件（讲稿）第十五章 Expression of target genes

基因工程流程分(离目的基因)爆切（割目的基因和载体)接（连目的基因和载体转专（化宿主细胞）1筛（选阳性克隆）"表（达目的基因）

分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆） 表（达目的基因） 基因工程流程

第十五章外源基因在细胞中的表达1.表达目的：(1)产生大量标记RNA探针：(2)产生突变型和野生型蛋白，研究蛋白质结构与功能。(3)生产商业性蛋白，如药物;(4)制备抗体；(5)捕捉相互作用的蛋白，研究相互作用

第十五章 外源基因在细胞中的表达 1.表达目的: (1)产生大量标记RNA探针； (2)产生突变型和野生型蛋白，研究蛋白质 结构与功能。 (3)生产商业性蛋白，如药物； (4)制备抗体； (5)捕捉相互作用的蛋白，研究相互作用

袁2.表达系统8 基因工程的表达系统有原核表达系统和真核.表达系统两大类1应用最为S原核表达系统是了解得最为深入，1广范的表达系统，1福稻1

2.表达系统 § 基因工程的表达系统有原核表达系统和真核 表达系统两大类。 § 原核表达系统是了解得最为深入，应用最为 广范的表达系统

u1宿主菌一般是经过改造后的1S原因：野生型细菌有针对外源DNA的限制修饰系统111111111改造菌株特点：61S不切割外源DNA1111S避免重组S改变细胞壁的通透性，提高转化效率。1118.在大肠杆菌是主要的克隆和表达宿主?拉1111111111111111

宿主菌一般是经过改造后的 § 原因：野生型细菌有针对外源DNA的限制修饰系统。 § 改造菌株特点： § 不切割外源DNA § 避免重组 § 改变细胞壁的通透性，提高转化效率。 § 在大肠杆菌是主要的克隆和表达宿主

游第一节原核基因表达的特点A克隆载体上加上转录和翻译调控序列即可使它变为表达载体V1111111111图1-3pBV220的物理图谱1.表达载体带有强启动子或组成型启动子或如lac或trp操纵子启动子、2PR、2PLEcoRI,Smal,BamHl,Sall,Hincll,Rstl,HindillT7噬菌体启动子。Xmml111Bglll1/PLt2.转录终止子和SD序列IIMBT1T21PRSspl-Xmnl3.外源基因与表达载体连接时，要能形HindillpBV220-HincllScalHindill成正确的开放读框CIts857-AmpHincll11Pvul3666bp4.AUG是首选起始密码子，-Bgll?orit1111a11

第一节 原核基因表达的特点 克隆载体上加上转录和翻译调控序列即可使它变为表达载体。 1. 表达载体带有强启动子或组成型启动子。 如lac或trp操纵子启动子、λPR、λPL 或 T7噬菌体启动子。 2.转录终止子和SD序列。 3.外源基因与表达载体连接时，要能形 成正确的开放读框。 4.AUG是首选起始密码子

吉社11pET-28a(+)载体iXho (158)Not l(166)Eag l(166)pET-28a(+) sequence landmarksHindl(173)T7promoter370-386Sal I(179)Sac l(190)369T7transcriptionstartECORI(192)270-287His·Tag coding sequenceBamHI(198)Nhel(231)207-239T7-TagcodingsequenceBpu1102I(80)Ndel(238)Multiple cloning sitesDrall(5127)Nco(296)Xbal(335)(BamHI-Xho))158-203Bql I(401)140-157His·Tag coding sequence1origin(4903-5358)SgrAl(442)26-72T7terminatorSphI(598)773-1852lacl coding sequence3286pBR322originKan (3995-4807)3995-4807Kan coding sequencePvu I(4426)Sgf(4426)4903-5358floriginSma l(4300)Mlul(1123)ThemapsforpET-28b(+)andpET-28c(+)lacl (773-1852)Bcl(1137)arethesameaspET-28a(+)(shown)withClal(4117)thefollowingexceptions:pET-28b(+)isaBstEIl(1304)Nrul(4083)5368bpplasmid;subtract1bpfromeachsitepET-28a(+)Apal(1334)beyondBamHIat198.pET-28c(+)isa(5369bp)5367bpplasmid;subtract2bpfromeachsite/BsSH Il(1534)beyondBamHIat198.Eco57 I(3772)ECORV(1573)Hpal(1629)AlwN I(3640)ori(328PshAI(1968)6BssSl(3397)BglI(2187)BSpLU11(3224)Sapl(3108)FspI(2205)Bst1107((2995)Psp5Il(2230)Tth111l(2969)

pET-28a(+) 载体 7

大肠杆菌作为基因工程宿主菌的优越性是迄今为止研究得最详尽的原核生物。S已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各种宿主菌和载体。S培养简单，繁殖迅速，培养代谢易于控制，易于进行工业化批量生产。S许多克隆的真核基因，如生长激素基因和胰岛素黏基因等，都可在大肠杆菌中实现高效表达

大肠杆菌作为基因工程宿主菌的优越性 § 是迄今为止研究得最详尽的原核生物。 § 已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥 有各种宿主菌和载体。 § 培养简单，繁殖迅速，培养代谢易于控制，易于 进行工业化批量生产。 § 许多克隆的真核基因，如生长激素基因和胰岛素 基因等，都可在大肠杆菌中实现高效表达

11局限性11S不具备真核生物的蛋白质复性系统；1.11S缺乏真核生物蛋白质加工修饰系统：1招蒙111造S内源蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，1/1成表达产物不稳定1111稻直E1E1111111[111111111意11111

局 限 性 § 不具备真核生物的蛋白质复性系统； § 缺乏真核生物蛋白质加工修饰系统； § 内源蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造 成表达产物不稳定

第二节克隆基因的表达表达策略：高效表达，此涉及增加载体的拷贝数和促进克隆基因的正确表达台1福图1-3pBV220的物理图谱表达大量蛋白的细胞比野生型细胞生长缓慢，使用可诱导启动子EcoRI,Smal,BamHl,Sall,Hincll,Rtl,Hindill有助于避免这一问题XmmlBglll11PLtIImBT112PRSspl-Xmnl表达的蛋白有毒性，构建分泌载HindillpBV220-HincllScal体(secretion vector)。分泌对细胞HindillCIts857-AmpHincllPvul3666bp的存活有利；分泌有利于蛋白纯化。Bgllorit1111减

第二节 克隆基因的表达 表达策略：高效表达，此涉及增加载体的拷贝数和促进克隆 基因的正确表达。 表达大量蛋白的细胞比野生型细 胞生长缓慢，使用可诱导启动子 有助于避免这一问题。 表达的蛋白有毒性，构建分泌载 体(secretion vector)。分泌对细胞 的存活有利；分泌有利于蛋白纯 化

u外源基因在原核细胞中表达的调节元件(1)常采用的启动子11①Lac启动子：111111无CAP-S突变的Lac启动子对分解代谢抑制不敏感，cAMP时也照常转录。S异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产量增加50倍S构建含有两个连续的Lac启动子载体，阻遏蛋白阻遏不完全，提高表达水平。1111111111111

外源基因在原核细胞中表达的 调节元件 (1)常采用的启动子 ①Lac启动子： § 突变的Lac启动子对分解代谢抑制不敏感，无CAP￾cAMP时也照常转录。 § 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产量增加50倍。 § 构建含有两个连续的Lac启动子载体，阻遏蛋白阻 遏不完全，提高表达水平