《分子生物学与基因工程》课程教学课件（讲稿）第六章 实验理论和技术 Methods in Molecular Biology and Genetic Engineering

核酸操作技术目录DNA重组大肠杆菌感受态细胞content的制备及转化

2 目录 content 核酸操作技术 DNA重组 大肠杆菌感受态细胞 的制备及转化

核酸操作技术“横向”体系电泳层析离心分光光度基因操作其它基本模式(离目的基因)分VVVVV切（割目的基因和载体）AATT纵向体系o)ACSacz接（连目的基因和载体）NAEcoRIMCSeme转 (化宿主细胞）G筛 (选阳性克隆)TAAMCS表 (达目的基因)

一 核酸操作技术 国外研究 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆） 表（达目的基因） 基 本 模 式 “ 纵 向” 体 系 “横向”体系 电泳 层析 离心 分光光度 基因操作 其它

核西酸操作技术内容基因操作：核酸分子的提取、切割、连接，核酸分子杂交，凝胶电泳，细胞转化，核酸序列分析，基因的人工合成，定点突变，PCR扩增，RNA干扰，文库构建RACE技术，基因芯片，基因敲除和转基因等。基因工程：是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子中，构建遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内进行持续稳定的繁殖和表达

一 核酸操作技术 内容 基因操作： 核酸分子的提取、切割、连接，核酸分子杂交，凝胶电泳，细胞转化，核酸 序列分析，基因的人工合成，定点突变，PCR扩增，RNA干扰，文库构建， RACE技术，基因芯片，基因敲除和转基因等。 基因工程： 是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子中，构建遗传物质的 新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内进行持续稳定的繁殖和表达

核酸操作技术分子实验先从枪和枪头开始4GILSON

一 核酸操作技术 分子实验先从枪和枪头开始

核酸操作技术分子实验先从枪和枪头开始

一 核酸操作技术 分子实验先从枪和枪头开始

核酸操作技术内容核酸提取核酸凝胶电泳PCR扩增酶切和重组

一 核酸操作技术 内容 u核酸提取 u核酸凝胶电泳 uPCR扩增 u酶切和重组

核酸操作技术（一）核酸提取基因组DNA的提取总RNA的提取基因组外核酸DNA的提取

一 核酸操作技术 （一）核酸提取 u基因组DNA的提取 u总RNA的提取 u基因组外核酸DNA的提取

核酸操作技术1.基因组DNA的提取制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤DNA提取两个原则：（1）防止和抑制DNaSe对DNA的降解；（2）尽量减少对DNA的机械剪切破坏。从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常采用在EDTA以及SDS或CTAB等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，再用酚抽提。获得的DNA经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR扩增、文库构建等实验HomogenizationIncubationSample loadingGeniomicDNAExtraction

一 核酸操作技术 1.基因组DNA的提取 u 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤。 u DNA提取两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对DNA的机械剪切 破坏。 u 从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常采用在EDTA以及SDS或CTAB等试剂存 在下用蛋白酶K消化细胞，再用酚抽提。获得的DNA经酶切后可用于Southern分析，还可用于 PCR扩增、文库构建等实验

核酸操作技术2.质粒DNA的提取质粒(plasmid)：细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。环状质粒、线性质粒；DNA质粒、：RNA质粒BacterialDNAPlasmid:特点%①染色体外的遗传因子Q②共价闭合环状的双链DNA；③大小为1-200kb;含对宿主有利的酶基因，并使宿主具有以下表型：a.产生抗性；b.产生抗素；c.降解有机物；d.生成大肠杆菌素；e.生成肠毒素；f.生成限制酶和修饰酶

一 核酸操作技术 2.质粒DNA的提取 u 质粒(plasmid)：细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。环状质粒、线性质粒；DNA质粒、 RNA质粒 u 特点 ①染色体外的遗传因子; ②共价闭合环状的双链DNA; ③大小为1-200kb; ④含对宿主有利的酶基因，并使宿主具有以下表型：a.产生抗性；b.产生抗素; c.降解有机物；d. 生成大肠杆菌素；e.生成肠毒素；f.生成限制酶和修饰酶

核酸操作技术2.质粒DNA的提取GGATCCCCTAGG启动子理想的质粒抗生素ACCGG抗性基因GGCC质粒pcDNA3拷贝数多Pyul5.4 kb抗生素B抗性基因GATC复制原点DVNCTAGColE1TenexiATCBsml两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨芒青霉素基因(ampr）、抗四环素基因(tetr);β-半乳糖苷酶基因(lacZ)。多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiplecloningsites,McS)

一 核酸操作技术 2.质粒DNA的提取 u理想的质粒 u拷贝数多 u复制原点 u两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr) 、抗四环素 基因(tet r)；β-半乳糖苷酶基因(lac Z) 。 u多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiple cloning sites,MCS)