《分子生物学与基因工程》课程教学课件（讲稿）第十二章 目的基因 Target genes

目的基因制取的基本策略目录PCR扩增法获得目的基因三文库法制取目的基因content四化学合成法

2 目录 content v 一 目的基因制取的基本策略 v 二 PCR扩增法获得目的基因 v 三 文库法制取目的基因 v 四 化学合成法

自的基因引言，你所感兴趣和想研究的基因，称为自的基因研究某个基因，或者要克隆某个基因用于生产大量DNA和蛋白质分子，首先都要把它从庞大的基因组中分离出来，需要克隆的DNA片段。编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系研究某基因与疾病的关系

引言 目的基因 n 你所感兴趣和想研究的基因，称为目的基因。 研究某个基因，或者要克隆某个基因用于生产大量DNA 和蛋白质分子，首先都要把它从庞大的基因组中分离出来。 需要克隆的DNA片段。 编码某种蛋白质 研究某基因结构和功能的关系 研究某基因与疾病的关系

目的基因引言目标基因剪接Kleismith&Kish (1995)CellandMolecularBiology,p.115人类胰岛素基因接入载体HumanInsulinStryer(1995) Biochemistry,p.119送入宿主细菌挑出所要群落大量培养生产得到纯系转殖菌株

人类胰岛素 Human Insulin 引言 目的基因

目的基因引言一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成自的基因，然后将之克隆表达；·另一类是构建生物个体的基因文库或cDNA文库，然后建立合适的筛选模型从文库中挑出含有自的基因的重组克隆

引言 目的基因 • 一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的 基因，然后将之克隆表达； • 另一类是构建生物个体的基因文库或cDNA文库，然后建立 合适的筛选模型从文库中挑出含有目的基因的重组克隆

自的基达制取的基本策略1.选择含目的基因的实验材料■染色体DNA1由mRNA反转录而得到的cDNA2.选择合适的方法制备DNA片段并克隆到分子克隆载体3.人工构建的重组体向寄主细胞内的转移4.选择合适方法筛选目的基因

一 目的基因制取的基本策略 1.选择含目的基因的实验材料 n 染色体DNA n 由mRNA反转录而得到的cDNA 2.选择合适的方法制备DNA片段并克隆到分子克隆载体 3.人工构建的重组体向寄主细胞内的转移 4.选择合适方法筛选目的基因

PCR扩增法获得目的基因策略：PCR产物克隆到载体中。普通PCR(PolymeraseChainReaction)反转录PCR（RT-PCR)RACE (Rapid Amplification of cDNAEnd)

二 PCR扩增法获得目的基因 • 策略：PCR产物克隆到载体中。 • 普通PCR（Polymerase Chain Reaction） • 反转录PCR（RT-PCR） • RACE（Rapid Amplification of cDNA End）

PCR扩增法获得自的基达（1）目的基因的直接克隆■适当的引物，PCR基因扩增法可以产生μg级的特异的靶DNA片段，达到这种数量级的基因组DNA可以直接克隆到相应的载体（如质粒或者M13载体，如pMD18-T) 中。(2）CDNA的克隆■利用PCR技术，只需增加一步逆转录反应，便可从少数的mRNA构建cDNA文库。以mRNA为模板，以oligo（dT）为引物，在依赖于RNA的DNA聚合酶催化下体外合成cDNA第一链之后，可通过PCR扩增此链

二 PCR扩增法获得目的基因 n （1）目的基因的直接克隆 n 适当的引物，PCR基因扩增法可以产生μg级的特异的靶DNA片段，达到这种 数量级的基因组DNA可以直接克隆到相应的载体（如质粒或者M13载体，如 pMD18-T）中。 n （2）cDNA的克隆 n 利用PCR技术，只需增加一步逆转录反应，便可从少数的mRNA构建cDNA 文库。以mRNA为模板，以oligo（dT）为引物，在依赖于RNA的DNA聚合 酶催化下体外合成cDNA第一链之后，可通过PCR扩增此链

PCR扩增法获得目的基因一（1）目的基因的直接克隆pMD18-T&pMD19-TVector的结构pMD18-T&pMD19-TEcoRVT-Cloning SiteVector(2,692 bp)pMD18-TVectorBcaBESTTMSequencing PrimerRVM(GAGCGGATAACAATTTCACACAGGXmalHinc IISmalAccl Ss0B3871laezEcoRISacIKpnlSamHI XbalEcoRVSallPstlSphHindGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGDigested by EcoR VCAGCACTGACCCTTTTGGGACCGCBcaBESTrSequencingPrimerM13-47...tetagagattatcgtcgacc(T-Cloning Site)pMD19-TVector--agatctctaTtagcagctgg

二 PCR扩增法获得目的基因 n （1）目的基因的直接克隆

PCR扩增法获得自的基因（2）cDNA的克隆定义：以提取的细胞总RNA或纯化的mRNA为模板，反转录获得cDNA，以基因特异性引物扩增获得特异基因的片段SSSSSSmRNA3CDNAB3IIS多宴

二 PCR扩增法获得目的基因 n （2）cDNA的克隆 n 定义：以提取的细胞总RNA或纯化的mRNA为模板，反转录获得cDNA，以 基因特异性引物扩增获得特异基因的片段

PCR扩增法获得自的基因（2）cDNA的克隆总RNA提取：防止RNA的降解和断裂，防止DNA的污染。两步法：先合成cDNA第一链，再进行PCR扩增。合成cDNA引物的选择：（1）随机六聚体引物：非特异，PCR引物赋予特异性，合成的cDNA中96%来源于rRNA。(2)Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。(3)特异性引物：引物与目标RNA互补，PCR扩增特异性高

二 PCR扩增法获得目的基因 n （2）cDNA的克隆 • 总RNA提取： 防止RNA的降解和断裂，防止DNA的污染。 • 两步法：先合成cDNA第一链，再进行PCR扩增。 • 合成cDNA引物的选择：（1） 随机六聚体引物：非特异，PCR引物赋予特 异性，合成的cDNA中96%来源于rRNA。 • （2） Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。 • （3）特异性引物：引物与目标RNA互补，PCR扩增特异性高