《分子生物学与基因工程》课程教学课件（讲稿）第十四章 Screening and identification of recombinant

分1总体技术路线基因载体目的基因切招接--礼转重组子筛1R福表

目的基因 基因载体 重组子 分 切 接转 筛 表总体技术路线

吉1.重组率BantiBantlBanhlBanhAnpTetrS重组子（目的重组子）foreign DNAplasmidvectorS自我连接载体（非重组BantBant子)吉祥S两个相互连接的载体以REDNA ligase及两个基因片段插入的+recombinatonplasmid载体（非目的重组子）恋Transformats grow inTransformats grow inthepresenceofboththepresenceofAmpTetandAmp1but not Tet1

1.重组率 § 重组子（目的重组子） § 自我连接载体（非重组 子） § 两个相互连接的载体以 及两个基因片段插入的 载体（非目的重组子）

2.转化率S转化菌中有一部分是重组子，还有非重组子11重组子中存在非目的重组子！S稻111重组子转化子目的重组子1111蒙1/

2. 转化率 § 转化菌中有一部分是重组子，还有非重组子。 § 重组子中存在非目的重组子。 转化子 重组子 目的重组子

1S由于重组率和转化率不可能达到理想极限因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目11的重组子与非目的重组子一一1111酒E清11111/11

§ 由于重组率和转化率不可能达到理想极限， 因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转 化子与非转化子、重组子与非重组子、目 的重组子与非目的重组子

福第十四章重组子的筛选与鉴定S遗传检测法物理检测法OT7.S三、杂交检测法8四免疫化学检测法确定外源DNA片段是否插入并与载体连接福

第十四章 重组子的筛选与鉴定 § 一、 遗传检测法 § 二、 物理检测法 § 三、 杂交检测法 § 四、 免疫化学检测法 确定外源DNA片段是否插入并与载体连接

111遗传检测法1111111111/11111111111E181.根据载体表型特征选择重组体分子1S_2.根据插入序列表型特征选择重组体分子1111福11?清?11稻/1111111-1111E11111

一、 遗传检测法 § 1．根据载体表型特征选择重组体分子 § 2．根据插入序列表型特征选择重组体分子

根据载体表型特征选择重组体分子S载体分子，都带有一个可选择的遗传标记或表型特征。根据载体分子的遗传特征进行选择，是获得重组体DNA分子细胞群体的必不可少的条件之一S（1)抗生素抗性基因插入失活选择法1S(2)β-半乳糖苷酶显色反应选择法

1．根据载体表型特征选择重组体分子 § 载体分子，都带有一个可选择的遗传标记或表型特 征。根据载体分子的遗传特征进行选择，是获得重 组体DNA分子细胞群体的必不可少的条件之一。 § (1) 抗生素抗性基因插入失活选择法 § (2) β-半乳糖苷酶显色反应选择法

(1)抗生素抗性基因插入失活选择S检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插人失-活效应(insertional inactivation)1S适用于带有抗生素抗性基因的克隆载体，将外源DNA插入到抗生素抗性基因序列内，该基因就失活设计一套含抗生素平板，可筛选出重组子。S四环素抗性基因(tet)和氨苄青霉素抗性基因(ampl)等11

(1)抗生素抗性基因插入失活选择 § 检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插人失 活效应(insertional inactivation)。 § 适用于带有抗生素抗性基因的克隆载体，将外源 DNA插入到抗生素抗性基因序列内，该基因就失活。 设计一套含抗生素平板，可筛选出重组子。 § 四环素抗性基因(tetr )和氨苄青霉素抗性基因(ampr ) 等

1111pBR3221111ClalEcORIHindill特点：EcoRVBamHIS多种抗药标记0SphlSallPvulTetS分子量低：4363bpPstl.Xmalll1NrulS 高拷贝1.1多单酶切位点Q3S不影响复制2Ori11111

pBR322 特点： § 多种抗药标记 § 分子量低：4363bp § 高拷贝 § 多单酶切位点 § 不影响复制

pBR322抗菌素标记选择11（1）四环素：1抑制细菌生长，但不杀死细菌1（2）氨苄青霉素抗性基因：产生口-内酰胺酶，使氨芒青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液反（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色1一景1福1111（3）环丝氨酸FA1杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌

（1）四环素： （2）氨苄青霉素抗性基因： pBR322抗菌素标记选择 产生￾-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉 酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI￾Aampicillin）（蓝灰色）褪色。 抑制细菌生长，但不杀死细菌。 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。 （3）环丝氨酸：