《分子生物学与基因工程》课程教学课件（讲稿）第十章 工具酶 Instrumental enzyme of gene engineering

山东翟子大客工具酶的基本概念基因工程的工具酶是应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、自目的基因选取、重组体DNA制备等程序中所需要的全部酶类

基因工程的工具酶是应用于基因工程的各种酶的总称，包 括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因选 取、重组体DNA制备等程序中所需要的全部酶类。 工具酶的基本概念

山东翟工大客第十章基因工程的工具酶限制性核酸内切酶二.DNA连接酶三DNA聚合酶四未端转移酶、单链核酸酶、逆转录酶等了解基因工程各种工具酶的性质，功能和用途

第十章 基因工程的工具酶 • 一 限制性核酸内切酶 • 二 DNA连接酶 • 三 DNA聚合酶 • 四 末端转移酶、单链核酸酶、逆转录酶等 了解基因工程各种工具酶的性质，功能和用途

山东邦大堂一、限制性内切酶 (Restriction Enzymes)1.细菌限制修饰系统（RestrictionandModificationSystemofBacteria)，人们对细菌对噬菌体的侵染存在的限制-修饰现象进行研究时，发现了限制性内切酶，提出限制-修饰假说在限制修饰系统中，限制作用是指细菌通过限制性酶的作用，破环入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等）；而细胞（如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏

一、限制性内切酶 (Restriction Enzymes) 1．细菌限制修饰系统（ Restriction and Modification System of Bacteria) • 人们对细菌对噬菌体的侵染存在的限制-修饰现象进行研究时，发现了 限制性内切酶，提出限制-修饰假说。 • 在限制修饰系统中，限制作用是指细菌通过限制性酶的作用，破坏入侵 的外源DNA(如噬菌体DNA等) ；而细胞(如宿主)自身的DNA分子合成 后，通过修饰酶的作用：在碱基特定的位置上发生了甲基化而得到了修 饰，可免遭自身限制性酶的破坏

山东翟工大学61.细菌限制修饰系统（Restriction andModification SystemofBacteria)SCAATCEcoRIMECORI限制性内切酶的主要功能是保护细菌不受噬菌体的限制作用修饰作用Me感染，这一观点已被人们MSATCHSCTTAASSATCMe广泛接受。EcoRI宁：核酸内切限制酶EcoRI及其修饰的甲基化酶MEcoRI的限制与修饰作用EcoRI识别序列经MEcoRI甲基化之后，就再不能被EcoRI所切割

1．细菌限制修饰系统（ Restriction and Modification System of Bacteria) § 限制性内切酶的主要功能 是保护细菌不受噬菌体的 感染，这一观点已被人们 广泛接受

山东翟工大客1.细菌限制修饰系统（RestrictionandModificationSystemofBacteria)限制性核酸内切酶：是识别DNA的BamHIGGATCC特异序列，并在识别点或其周围切CCTAGGBamHI割双链DNA的一类内切酶，Altered sequenceAGTCTnotSequenceAGGCTrecognized,soAArecognized andGATCCrestriction enzymecut by'restrictioneisinactiveCCTAGGenzyme'CStickyends工Sincethe restriction enzyme onlycutsataparticularDNAsequence,inthiscase"AGGCT.the enzymewill only cut when itrecognizes this exact se-quence.Even ifaslittleasoneletterischanged(forexample,fromGtoT),therestrictionenzymewillnolongercut

1．细菌限制修饰系统（ Restriction and Modification System of Bacteria) 限制性核酸内切酶：是识别 DNA的 特异序列，并在识别点或其周围切 割双链DNA的一类内切酶

山东翟工大客1.细菌限制修饰系统（RestrictionandModificationSystemofBacteria)限制性核酸内切酶：是识别DNA的特异序列4+1并在识别点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制酶切割DNA分子过程示意

1．细菌限制修饰系统（ Restriction and Modification System of Bacteria) 限制性核酸内切酶：是 识别 DNA的特异序列， 并在识别点或其周围切 割双链DNA的一类内 切酶

山东工大客1.细菌限制修饰系统（RestrictionandModificationSystem ofBacteria)因他们发现了限制性酶并应用于分子遗传学而获1978年度诺贝尔生理医学奖。W. Arber (1929 -)H.O.Smith (1931 (-)BiozentrumderUniversitatBasel,Johns HopkinsUniversity SchoolSwitzerlandofMedicine,USA

1．细菌限制修饰系统（ Restriction and Modification System of Bacteria) 因他们发现了限 制性酶并应用于 分子遗传学而获 1978年度诺贝尔 生理医学奖。 W. Arber (1929 –) H. O. Smith (1931 －) Biozentrum der Universität Basel, Johns Hopkins University School Switzerland of Medicine,USA

山东翟工大学1.细菌限制修饰系统（RestrictionandModificationSystemofBacteria)限制性内切酶近4000种ANON-GOINGCOMMITMENTTO240THEDISCOVERYANDCLONINGOF220已发现了超过250种的特异RESTRICTION ENZYMES200AVAILABLEFROM NEB识别序列。其中30%是在180CLONED AT NEB160NEB(New England140120Biolabs）发现的。10D80除了某些病毒和低等真核生6040物以外，限制性内切酶只在20原核生物中被发现1975198019852000199019952004

1．细菌限制修饰系统（ Restriction and Modification System of Bacteria) § 限制性内切酶近4000种， 已发现了超过250种的特异 识别序列。其中30%是在 NEB（New England Biolabs）发现的。 § 除了某些病毒和低等真核生 物以外，限制性内切酶只在 原核生物中被发现

山东邦大学2.限制性内切酶的分类（p13，表2-1）「型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体。它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链Ⅱ型限制性内切酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链Ⅲ型限制性内切酶也是兼有限制-修饰两种功能的酶。它们在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列；它们很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化

2.限制性内切酶的分类（p13，表2-1） § I型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多个亚基的蛋 白复合体。它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链。 § II型限制性内切酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。 § III型限制性内切酶也是兼有限制-修饰两种功能的酶。它们在识别位点之 外切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列；它们很少能产生完 全切割的片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化

山东翟工大学限制性酶的类别与活性Ⅱ型酶II型酶I型酶蛋白结构内切酶亚基和甲基2亚基的双功3亚基的双功能酶能酶化酶亚基分开识别位点4～6bp序列5~7bp两侧对称或不对称常为回文不对称序列剪切位点在限制位点限制位点上游离限制位点>1000bp的非特异位点24～26bp处限制与甲活性分开同时存在互相排斥基化

限制性酶的类别与活性 Ⅱ型酶 Ⅲ型酶 Ⅰ型酶 蛋白结构 内切酶亚基和甲基 化酶亚基分开 2 亚基的双功 能酶 3 亚基的双功能酶 识别位点 4～6bp 序列 常为回文 5～7bp 不对称序列 两侧对称或不对称 剪切位点 在限制位点 限制位点上游 24～26bp 处 离限制位点 >1000 bp 的非特异位点 限 制 与 甲 基化 活性分开 同时存在 互相排斥