《分子生物学与基因工程》课程教学课件（讲稿）第十一章 载体 Selection and cons truction of gene vectors

第十一章基因载体的选择与构建载体的一般特性=质粒载体入噬菌体载体四cos质粒（cosmid）五人造染色体载体（酵母人工染色体，细菌人工染色体载体和噬菌体人工染色体载体

第十一章 基因载体的选择与构建 • 一 载体的一般特性 • 二 质粒载体 • 三 λ噬菌体载体 • 四 cos质粒（cosmid） • 五 人造染色体载体（酵母人工染色体，细菌人工染色体载 体和噬菌体人工染色体载体）

一、载体（vector）的一般特性分子克隆载体是可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。1.载体功能：·为外源基因提供进入受体细胞的转移能力；·为外源基因提供在受体细胞的复制能力或整合能力；·为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力

一、载体(vector)的一般特性 l 分子克隆载体是可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适 当宿主细胞的DNA分子。 1.载体功能: • 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力； • 为外源基因提供在受体细胞的复制能力或整合能力； • 为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力

(一）、发展概况·第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101ColE1, pCR, pBR313。·第二阶段：增大载体容量，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。第三阶段：进一步完善载体的功能以满足基因工程克隆中的不同要求。VectorTypeExpression(212)ThermoFisherSCIENTIFICCloning (84)CloningtorSequencing(13)RNAI(7)DNAAssembly (5)Two Hybrid (1)

（一）、发展概况 • 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, ColE1, pCR, pBR313。 • 第二阶段：增大载体容量，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。 • 第三阶段：进一步完善载体的功能以满足基因工程克隆中的不同要求。 4

（二）、载体的结构特点至少有一个复制起点，至少可在一种生物体中有效复制，稳定遗传·至少有一个限制酶识别位点，供外源DNA插入，·至少有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞，·具有较小的分子量和较高的拷贝数，，具有对受体细胞的可转移性，提高载体导入受体细胞的效率

（二）、载体的结构特点 • 至少有一个 ，至少可在一种生物体中有效复制，稳定遗传， • 至少有一个 ，供外源DNA插入， • 至少有一个 ，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞， • 具有 的分子量和 的拷贝数， • 具有对受体细胞的 , 提高载体导入受体细胞的效率

一个理想的载体应具备以下的特点：·（1)能自主复制·（2)易于分离和纯化；·（3）含有可供选择的遗传标记·(4)含酶切位点·(5)不含与复制无关的区域·（6)不影响宿主的生长和繁殖

一个理想的载体 应具备以下的特点: • (1)能自主复制; • (2)易于分离和纯化; • (3)含有可供选择的遗传标记; • (4)含酶切位点; • (5)不含与复制无关的区域; • (6)不影响宿主的生长和繁殖。 6

* (1)质粒(Plasmid)，主要指人工构建（三）、载体的种类的质粒。* (2)噬菌体的衍生物，噬菌体DNA改·在基因工程中所用的造。载体，主要有： (3)柯斯质粒(cosmid)，质粒与噬菌体DNA重组。Expression plasmids* (4)动物病毒，天然病毒染色体改造。transfectedintohumarellculture* (5)人工染色体，人工重组构建，用于基因组计划

（三）、载体的种类 • 在基因工程中所用的 载体，主要有： v (1) (Plasmid)，主要指人工构建 的质粒。 v (2) 的衍生物，噬菌体DNA改 造。 v (3) 柯斯质粒(cosmid)，质粒与噬菌 体DNA重组。 v (4) ，天然病毒染色体改造。 v (5) ，人工重组构建，用于 基因组计划

（四）、遗传标记基因·1.标记基因的作用：·指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞；·指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。·2.标记基因的种类：·抗性标记基因·营养标记基因·生化标记基因

（四）、遗传标记基因 • 1.标记基因的作用： • 指示外源DNA分子（载体或重组分子） 宿主细胞； • 指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了 。 • 2.标记基因的种类： • 抗性标记基因 • 营养标记基因 • 生化标记基因

3.常用的遗传标记基因四环素抗性基因（Tet）抑菌剂，Tetracycline可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。抑制细胞蛋白质合成，细胞停止生长四环素抗性基因编码一种399AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞

（Tet r） 抑菌剂，Tetracycline可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑 制核糖体的转位过程。抑制细胞蛋白质合成，细胞停止生长。 四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环 素分子进入细菌细胞。 3.常用的遗传标记基因

EcoR14361Cla123Hindill29Aatll4286EcoRV185Sspl4170Nhe12294000BamH1375Sph/562Sca13846ECON1622Pvul3735Sa/l651PshA1712Pst13809Ap'Vsp13539TerXmalll939Bsa13435Nrul9721000Eam110513363pBR322BspM110634,363bpBsm113533000Styl1369Ava11425A/wN12886Msc11444oriBstAP11580Bsgl1650Kpn211664Mam11668AflllBspLU11|>2475Ndel2297BsaA122272000Bsf110712246/Esp312124Pvull2066Tth11112219面

的基因回路

氨芒青霉素抗性基因（Amp）杀菌剂，Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性，干扰细胞分裂，杀死细胞。Ampr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β-内酰胺环Smal的水解，使氨芒青霉素失活。EcoRBamHISallPtLHind illAAGGAGgaattcccggggatccgtcgacctgcagccaagcttSDMCSrrnBPRPLpBV2203666bpClts857Amprori

杀菌剂，Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性， 干扰细胞分裂，杀死细胞。 Ampr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β-内酰胺环 的水解，使氨苄青霉素失活