南京农业大学：《分子生物学》实验课程教学课件（讲稿）实验二 质粒DNA的限制性内切酶酶切

分子生物学实验实验二质粒DNA的限制性内切酶酶切

实验二 质粒DNA的限制性内切酶酶切

实验目的了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定

一 实验目的 了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的 DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、 连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是 DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定

第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。第二类（II型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆

第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点 附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没 有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中 用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。 第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内 的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷 酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工 具酶之一。 第三类（ III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回 文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几 个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定 长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆

二实验原理IⅡI型酶识别的DNA序列一般含有4～6个核苷酸。有的在识别顺序的对称轴上对双链DNA同时切割产生平末端：有的在识别顺序的双侧末端DNA双链产生粘性末端。Ⅱ型限制性内切需要Mg2+激活，大部分II型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。质粒DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列，可被相应限制性内切酶切出相应数量的切口，从而产生相应数量的酶切片断。本实验采用PMD18-T质粒具有EcoRI和Hind的识别序列和酶切位点分别为AAGCTTGAATTC和CTTAAGTTCGAA

二 实验原理 Ⅱ型酶识别的DNA序列一般含有4～6个核苷酸。有的在识别顺序 的对称轴上对双链DNA同时切割产生平末端；有的在识别顺序的双侧末 端DNA双链产生粘性末端。Ⅱ型限制性内切酶需要Mg2+激活，大部分Ⅱ 型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。 质粒DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列，可 被相应限制性内切酶切出相应数量的切口，从而产生相应数量的酶切 片断。 本实验采用PMD18-T质粒具有EcoRⅠ和Hind的识别序列和酶切位 点分别为 GAATTC 和 AAGCTT CTTAAG TTCGAA

pMD18-T&pMD19-TVector的结构pMD18-T&pMD19-TECORVT-Cloning SiteVector(2,692 bp)pMD18-TVectorBcaBESTTM sequencing Primer RV-MGAGCGGATAACAATTTCACACAGGXmalHincIIAccI Sse8387ISmalECORISacIKpnIBamHI Xbal EcoRy SaliPstisph HindlaczGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGDigested by EcoR VCAGCACTGACCCTTTTGGGACCGCBcaBESTSequencingPrimerM13-47tctagagatTatcgtcgacc.(T-Cloning Site)pMD19-TVectoragatctctaTtagcagctggBcaBESTTM sequencing Primer RV-MHinc IIGAGCGGATAACAATTTCACACAGGSse83871AccIXmallaczSa/IEcoRy Xbal BamHISmalKpnISacI EcoRIHindIISphIPstIGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGDigestedbyEcoRVCAGCACTGACCCTTTTGGGACCGCBcaBESTSequencing PrimerM13-47-gtcgacgatTatctctaga(T-Cloning Site)cagctgctaTtagagatct

三实验步骤质粒检测：电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7一1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染

质粒检测： 电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开 环、线型三种构型。 吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值， 若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好， 1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。 三 实验步骤

取实验一中提取的质粒，向其中加入10uL灭菌的双蒸水使其充分溶解，测定其dsDNA浓度。然后按下表进行操作：实验组对照组0Buffer430EcolI30HindⅡ质粒XXddHO10-X20-X总体积2020充分混匀后于37℃保温1-2h（注最终反应体系中质粒浓度至少达到1.2-1.5μg/uL）

取实验一中提取的质粒，向其中加入10μL灭菌的双蒸水使其充分 溶解，测定其dsDNA浓度。然后按下表进行操作： 实验组 对照组 Buffer 4 0 EcolⅠ 3 0 Hind Ⅲ 3 0 质粒 X X ddH2O 10-X 20-X 总体积 20 20 充分混匀后于37℃保温1-2h。 （注最终反应体系中质粒浓度至少达到1.2-1.5μg/μL）

四实验结果6.05.713.03.81泳道 maker2.01.92泳道质粒DNA3泳道酶切产物五注意事项操作过程避免污染，反应体系中各试剂用量准确六习题1、影响限制性酶切的因素有哪些？2、结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？3、限制性内切酶在基因工程中有什么作用？

四 实验结果 五 注意事项 操作过程避免污染，反应体系中各试剂用量准确。 六 习 题 1 2 3 1泳道 maker 2泳道 质粒DNA 3泳道 酶切产物 3.0 6.0 2.0 5.7 3.8 1.9 1、影响限制性酶切的因素有哪些？ 2、结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？ 3、限制性内切酶在基因工程中有什么作用？