南京农业大学：《分子生物学》实验课程教学课件（讲稿）实验一 质粒DNA的提取

分子生物学实验实验一质粒DNA的提取4pal(178)ALPHAP(BLA)FoRI(397)40aL(2367)tr1(413)a(413)Sral(415)Arm(41s)APpUC19Pa(440)2686bpindl(448)P(LAC)ORI

实验一 质粒DNA的提取 pUC19 2686 bp A Pr P(BLA) ALPHA P(LAC) ORI AvaI (413) BamHI (418) EcoRI (397) HindIII (448) PstI (440) SmaI (415) XmaI (413) ApaLI (178) ApaLI (1121) ApaLI (2367)

实验目的掌握碱裂解法分离质粒DNA的基本原理和操作要点了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术实验原理质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子，具有双链共价闭环结构的DNA分子。是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cCcDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子

一 实验目的 掌握碱裂解法分离质粒DNA的基本原理和操作要点。 了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子，具有双链共价闭环结构的 DNA分子。是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分 子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 二 实验原理

培养细菌使质粒扩增单链切割在接收集和裂解细菌三个基本步骤分离和纯化质粒DNA(b)共价闭环DNA（cCcDNA）线状DNA（1cDNA）质粒存的形态开环DNA（ocDNA）单链国制连(c)

培养细菌使质粒扩增 收集和裂解细菌 分离和纯化质粒DNA 共价闭环DNA（cccDNA） 线状DNA（lcDNA） 开环DNA（ocDNA） 三个基本步骤 质粒存的形态

碱裂解法利用宿主菌巨大线状染色体DNA与相对较小的闭环双链质粒DNA的结构的差异来提取质粒DNA。碱变性DNA时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当去除变性条件时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋状分子，而难于复性的长链线状的基因组DNA则与破裂的细胞壁、细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖，当K+取代Na+时这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去

碱裂解法利用宿主菌巨大线状染色体DNA与相对较小的闭 环双链质粒DNA的结构的差异来提取质粒DNA。 碱变性DNA时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓 扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当去除变性条件时（酸 中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋状分 子，而难于复性的长链线状的基因组DNA则与破裂的细胞壁、 细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖，当K+取代Na+ 时这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被 离心除去

质粒检测：电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7一1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染

质粒检测： 电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的 超螺旋、开环、线型三种构型。 吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波 长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之 间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白 质污染，大于1.8说明有RNA污染

三实验步骤接含质粒的单菌落于2mlLBAmp+液体培养基中A37°℃C，190rpm振荡培养过夜2取2.0mL菌液入2.0ml的dorf管中15000rpm、离心5min，弃上清，收集菌体A200uL溶液I+5uLRNA酶悬浮菌体（充分混匀），冰上静置5minA加入400uL溶液II（轻轻混匀），室温静置5min裂解菌体八加入30OuL溶液III（轻轻混匀），冰上静置5min质粒DNA复性

接含质粒的单菌落于2ml LB Amp+液体培养基中  370C，190rpm振荡培养过夜  取2.0mL菌液入2.0ml的dorf管中 5000rpm、离心5min，弃上清，收集菌体  200uL溶液I+5uLRNA酶悬浮菌体（充分混匀），冰上静置5min  加入400uL溶液II（轻轻混匀），室温静置5min裂解菌体  加入300uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置5min质粒DNA复性 三 实验步骤

4℃，10000rpm，离心10min，取700μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管加700uL的氯仿：异戊醇［V:V=24:1］（混匀），冰上静置5minA4℃，10000rpm，离心10min，取500μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管2加1.0mL无水乙醇（充分混匀），-20℃放置20min儿4℃，10000rpm，离心10min，弃上清2加入500L70%乙醇，将沉淀悬起A4℃，5000r/min离心5min，弃上清（用软纸将管内乙醇吸干）即可

 4℃ ，10000rpm，离心10min，取700μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管  加700μL的 氯仿：异戊醇［V:V＝24:1］（混匀），冰上静置5min  4℃ ，10000rpm，离心10min，取500μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管  加1.0mL无水乙醇（充分混匀），-20℃ 放置20min  4℃ ，10000rpm，离心10min ，弃上清  加入500μL 70%乙醇，将沉淀悬起  4℃，5000 r/min离心5min，弃上清（用软纸将管内乙醇吸干）即可