南京农业大学：《分子生物学》实验课程教学课件（讲稿）实验三 DNA的琼脂糖凝胶电泳

分子生物学实验实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳

1 实验三 DNA的琼脂糖凝胶电泳

一实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视

2 一 实验目的 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶 被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经 发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要 实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如： DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限 制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视

实验原理DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。核酸为两性分子，在pH3.5时，整个分子带正电；pH8左右时，整个分子带负电。在碱性环境下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。共价闭环超螺旋DNA>直线DNA>开环的双链环状DNA

3 二 实验原理 DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 核酸为两性分子，在pH3.5时，整个分子带正电； pH8左右时，整个分子带负电。 在碱性环境下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的，把这 些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结 构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的 速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳 的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量 的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。共价闭环超螺旋DNA＞直线 DNA＞开环的双链环状DNA

实验原理wells1kbladde19810,180NegativelargerpoleA-Hindlllfragmentselectrodepieces.1023,1305.0904,0729,4163,0546,5574,3612,0361,6362,322DNA2,027Fragments1,0185065173963smaller298electrodepiecesPositivepole

4 二 实验原理

凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。凝胶类型及浓度分离DNA片段的大小范围（bp）0.3%琼脂糖50 000~1 0000.7%琼脂糖20 000~1 0001.4%琼脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2550~120.0%聚丙烯酰胺

5 凝胶类型及浓度 分离DNA片段的大小范围（bp） 0.3%琼脂糖 50 000~1 000 0.7%琼脂糖 20 000~1 000 1.4%琼脂糖 6 000~300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000~100 10.0%聚丙烯酰胺 500~25 20.0%聚丙烯酰胺 50~1 凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝 胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之， 浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱

琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间PowersourceClones?6Sample wells in gelGelslabClothwickVectorElectrolytesolution+DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。6

6 DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压、电场方向、嵌 入染料的存在、电泳缓冲液的组成。 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间

在紫外线的照射下结合溴化EB（溴化乙锭）能插入DNA分子碱基对之间，导乙锭的DNA分子发出荧光致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给CionesEB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均MMkb可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。电泳时所需DNA样品量仅0.5～1 μg.8-EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下<Vector3-15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更2少的DNA即可检出；可以加到样品中或胶中。EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃

7 EB(溴化乙锭) 能插入DNA分子碱基对之间，导 致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给 EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均 可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。电 泳时所需DNA样品量仅0.5～1μg. EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下 15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更 少的DNA即可检出；可以加到样品中或胶中。 EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废液 要经过处理才能丢弃。 在紫外线的照射下结合溴化 乙锭的DNA分子发出荧光

三实验步骤品品出-称样溶解加热制板倒胶检测点样取样电泳

8 三 实验步骤 称样 溶解 加热 制板 倒胶 取样 点样 电泳 检测

三 实验步骤制胶—1.0%琼脂糖凝胶（50ml)0凝胶板的制备一—小心加入2一3uIEB，摇匀（污染EB吸头，不宜再回收使用）2点样一一样品20ml，与4ml溴酚兰混匀（DNAmaker3ul加入10μl水与4μl溴酚兰混匀）1电泳——稳压80v，DNA向阳极移动，大约50-60min7观察和拍照——254nm紫外灯下观察

9 三 实验步骤 制胶 —— 1.0 ％琼脂糖凝胶 (50ml)  凝胶板的制备 ——小心加入2－3μlEB，摇匀（污染EB吸头，不宜再回收使用）  点样—— 样品20μl，与4μl溴酚兰混匀 ( DNA maker 3μl 加入10μl水与4μl溴酚兰混匀)  电泳——稳压 80v，DNA向阳极移动, 大约50-60min  观察和拍照——254nm紫外灯下观察

3456四实验结果4泳道maker1泳道质粒DNA酶切质粒片段2、3、5、6泳道酶切产物五注意事项EB是一种诱变剂，操作时必须戴塑料或乳胶手套！！！六习题1.琼脂糖凝胶电泳的适用范围？2.影响琼脂糖凝胶电泳的因素有哪些？10

10 四 实验结果 五 注意事项 EB是一种诱变剂，操作时必须戴塑料或乳胶手套!!! 六 习 题 1. 琼脂糖凝胶电泳的适用范围？ 2.影响琼脂糖凝胶电泳的因素有哪些？ 4 泳道 maker 1 泳道 质粒DNA 2、3、5、6泳道 酶切产物 1 2 3 4 5 6 质粒 酶切 片段