南京农业大学：《动物生物化学》实验教学课件（讲稿）实验六 分子筛凝胶过滤分离血红蛋白和核黄素

南京广业大学RTLA动物生物化学实验凝股过滤实验六层析技术分子筛凝胶过滤分离血红蛋白和核黄素动物医学院动物生化教研室

1 实验六 层析技术 分子筛凝胶过滤分离血红蛋白和核黄素 动物医学院动物生化教研室 动物生物化学实验

一、实验目的学习层析技术的基本原理掌握凝胶层析法分离混合物的基本原理了解凝胶层析法的分离血红蛋白的基本操作32

2 ① 学习层析技术的基本原理 ② 掌握凝胶层析法分离混合物的基本原理 ③ 了解凝胶层析法的分离血红蛋白的基本操作 一、实验目的

二、层析技术①1903年，俄国科学家M.C.Jber首创了一种从绿叶中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色谱法（Chromatography），由于翻译和习惯的原因。又常称为层析法。②80多年来，层析法不断发展，形式多种多样。50年代开始，相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。③几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化高技术，在生化领域内得到了广泛的应用

3 二、层析技术 ① 1903年，俄国科学家M.C.Jber首创了一种从绿叶中分离多种不 同颜色色素成分的方法，命名为色谱法(Chromatography)，由 于翻译和习惯的原因．又常称为层析法。 ② 80多年来，层析法不断发展，形式多种多样。50年代开始，相 继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸 附层析等。 ③ 几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化高技术，在生 化领域内得到了广泛的应用

层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸、appifedi

4 层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学 性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另 一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的 目的。 可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸

层析技术分类名称固定相流动相操作方式分离依据纸层析液体液体溶解度分配层析薄层层析带电性固体液体离子交换层析离子交换柱层析静电引力固体液体吸附薄层层析吸附层析吸附力气体气体吸附层析固体酶与底物固体液体亲合层析配体专一性抗原与抗体固体液体分子大小凝胶层析凝胶过滤15

5 层析技术分类 名称 操作方式 固定相 流动相 分离依据 分配层析 纸层析 薄层层析 液体 液体 溶解度 离子交换层析 离子交换柱层析 固体 液体 带电性 静电引力 吸附层析 吸附薄层层析 气体吸附层析 固体 固体 液体 气体 吸附力 亲合层析 酶与底物 抗原与抗体 固体 液体 配体专一性 凝胶层析 凝胶过滤 固体 液体 分子大小

三、凝胶层析技术概念：凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析，当生物大分子随流动相通过装有作为固定相的凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。原理：凝胶颗粒内部具有多孔性网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来

6 三、凝胶层析技术 概念：凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析，当生物大分子随流动相通过装有作 为固定相的凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技 术。 原理：凝胶颗粒内部具有多孔性网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝 胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并 最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在 柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来

小分子人分了洗脱上样洗脱多孔凝胶球888:8样品小分多孔凝胶球尼龙网或多孔板大分了TT收集收集收集凝胶过滤凝胶层析的原理分子大小不同混合物上柱：洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；大小分子分开：大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中

7 凝胶层析的原理 分子大小不同混合物上柱； 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外； 大小分子分开： 大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中

固定相：各种多孔凝胶，填充于层析柱中流动相：洗脱剂，缓冲液或蒸馏水凝胶过滤所用的介质是由交联葡聚糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。Sephadex-葡聚糖凝胶Sepharose-琼脂糖凝胶Sephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶

8 固定相： 各种多孔凝胶，填充于层析柱中 流动相： 洗脱剂，缓冲液或蒸馏水 凝胶过滤所用的介质是由交联葡聚糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶 珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。 Sephadex-葡聚糖凝胶 Sepharose-琼脂糖凝胶 Sephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶

分子筛凝胶过滤分离血红蛋白和核黄素原理：当含有不同大小分子的混合物经过葡聚糖凝胶（G-25）时，核黄素（黄色，分子量370）进入介质内部孔隙，而大分子的血红蛋白（红色，分子量64500）则被排阻在介质之外，从而达到分离的目的。葡聚糖凝胶（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚aCHCo糖，它是一种以右旋葡萄糖为残基的多糖，分子HOFCH.间主要是α-1,6-糖苷键（约占95%），分枝为uolCH1，3-糖苷键（约占5%），以1-氯-2,3-环氧丙烷为交联剂将链状结构连接为三维空间的网状结构10的高分子化合物

9 分子筛凝胶过滤分离血红蛋白和核黄素 原理：当含有不同大小分子的混合物经过葡聚糖凝胶（G-25）时，核黄 素（黄色，分子量370）进入介质内部孔隙，而大分子的血红蛋白（红色， 分子量64500）则被排阻在介质之外，从而达到分离的目的。 葡聚糖凝胶（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚 糖，它是一种以右旋葡萄糖为残基的多糖，分子 间主要是α-1,6-糖苷键（约占95%），分枝为 l,3-糖苷键（约占5%），以1-氯-2,3-环氧丙烷 为交联剂将链状结构连接为三维空间的网状结构 的高分子化合物

小分子蛋白质大分子蛋白质葡聚糖凝胶A280凝胶过滤分离蛋白质大球是葡聚糖凝胶颗粒a样品上柱后，小分子进入凝胶微孔，大分o子不能进人，故洗脱时大分子先洗脱下来C.小分子后洗脱出来10

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