南京农业大学：《分子生物学》实验课程教学课件（讲稿）实验六 RT-PCR（扩增）

分子生物学实验实验六RT-PCR一一扩增

实验六 RT-PCR -扩增

一实验目的掌握扩增的基本原理和方法。了解琼脂糖凝胶电泳对目的基因的检测方法PCR的原理类似于DNA的天然复制过程。即在模板DNA、寡核苷酸引物、四种脱氧核苷酸（dNTP）底物和Mg2+存在的条件下，由耐热的TaqDNA聚合酶催化DNA的复制，合成靶DNA。PCR包括三个基本过程：（1）变性：加热模板使其离解成单链。（2）退火：降低温度使人工合成的聚核苷酸引物与模板DNA种所要扩增的靶序列的两侧按碱基配对原则相结合。（3）延伸：在适宜条件下，TaqDNA聚合酶利用dNTP使引物3'端向前延伸，合成与模板碱基完全互补的DNA链

一 实验目的 掌握扩增的基本原理和方法。 了解琼脂糖凝胶电泳对目的基因的检测方法 PCR的原理类似于DNA的天然复制过程。即在模板DNA、寡核苷酸引物、四 种脱氧核苷酸（dNTP）底物和Mg2+存在的条件下，由耐热的TaqDNA聚合酶 催化DNA的复制，合成靶DNA。PCR包括三个基本过程： （1）变性: 加热模板使其离解成单链。 （2）退火 :降低温度使人工合成的聚核苷酸引物与模板DNA种所要扩增的靶序列 的两侧按碱基配对原则相结合。 （3）延伸 :在适宜条件下，Taq DNA聚合酶利用dNTP使引物3’端向前延伸，合成 与模板碱基完全互补的DNA链

PCR的基本原理23高温变性 低温退火适温延伸重复1~3步25~30轮94目的DNA片段温度扩增100万倍以上72(℃)子链延伸55DNA加倍链DNA单链与引物复性22DNA双螺旋13245时间（min）

1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温 度 （℃） PCR的基本原理 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA 变 性 形 成 2 条 单 链 子链延伸 DNA加倍

MD-2对TLR4的功能具有调控作用，是TLR4识别LPS，介导炎症反应过程中的重要辅助分子和调控分子，可以在配基识别、信号转导和表达分布几个水平调控TLRs的功能。MID-2 可以影响TLR4在细胞内的分布，并促进TLR2和TLR4 的表达。MD-2是分泌性蛋白质，由二硫键连接成稳定的二聚体或寡聚体、聚集体。有远距离广泛作用的可能性。TLR4是多种细胞内介导LPS信号的关键分子，MD-2与TLR4存在伴随表达关系，它提示细胞对LPS的反应性与MID-2和TLR4的表达水平密切相关。MD-2是天然免疫中的调控分子，其可以在验证、感染、免疫等病理生理过程当中具有极为广泛的生物学功能价值。Table 2 Oligonucleotide PCR primersGenePrimers sequence (5'-3)OrientationProduct size (bp)Genbank accession number18s535AF173612CGGACATCTAAGGGCATCAForwardAAGACGGACCAGAGCGAAAreverseMD2-FForward1028GCTTTCTCCCATATTTACTCAATCTTATACAGGGTTCAGreverseMD2-R

MD-2 对 TLR4 的功能具有调控作用，是 TLR4 识别 LPS，介导炎症反应过 程中的重要辅助分子和调控分子,可以在配基识别、信号转导和表达分布几个水平 调控 TLRs 的功能。 MD-2 可以影响 TLR4 在细胞内的分布，并促进 TLR2 和 TLR4 的表达。 MD-2 是分泌性蛋白质，由二硫键连接成稳定的二聚体或寡聚体、聚集体。 有远距离广泛作用的可能性。TLR4 是多种细胞内介导 LPS 信号的关键分子， MD-2 与 TLR4 存在伴随表达关系，它提示细胞对 LPS 的反应性与 MD-2 和 TLR4 的表达水平密切相关。 MD-2是天然免疫中的调控分子，其可以在验证、感染、免疫等病理生理过程 当中具有极为广泛的生物学功能价值

CD14JLR4LPSLBIMD-2MembraneMDB8IBAK1ECSITRAP6TABMAPKKK8TAKMAPKK1INIKERK,p38IkBJNK/SAPKdegradationIKK0nJun/FosIkB-CB2InnuneresponegenesFig1TLR4MiD2 signaling pathway

实验步聚CDNA2uLPremix Taq12.5 uL引物11 uLMix 23 μL引物21uLDEPC水to 25 uL94℃72℃94℃30s60℃30s72℃4℃5minlmin10min1hYY++++1Y++32Cycle反应结束后，向每管中加入3uL溴酚兰，混匀，取18uL进行琼脂糖凝胶电泳

cDNA 2 uL Premix Taq 12.5 uL 引物1 1 uL 引物2 1 uL DEPC水 to 25 uL 94℃ 5min 94℃ 30s 60℃ 30s 72 ℃ 1min 72 ℃ 10min 4 ℃ 1h 32 Cycle 三 实验步聚 ｝Mix 23 μL 反应结束后，向每管中加入3uL溴酚兰，混匀，取18uL进行琼脂糖凝胶电泳

四实验结果通过电泳鉴定PCR产物的纯度及大小是否正确通过相应的计算机软件对胶条进行灰度扫描，确定目的基因与参比基因的比值。M+MD2+18S

四 实验结果 通过电泳鉴定PCR产物的纯度及大小是否正确。 通过相应的计算机软件对胶条进行灰度扫描，确定目的基因与参比基因的比值