福州大学：《酶学及其应用》课程教学课件（PPT讲稿）第三章 酶的纯化 3.3

1 色谱分离法 参考 生物大分子的液相色谱制备 第二版，师治 贤编著，科学出版社 生物工程下游技术——细胞培养、分离纯 化，分析检测，刘国诠编，化学工业出版 社，1993

1 色谱分离法 参考 生物大分子的液相色谱制备 第二版，师治 贤编著，科学出版社 生物工程下游技术——细胞培养、分离纯 化，分析检测，刘国诠编，化学工业出版 社，1993

2 色谱种类 相互作用力类型 特点 体积排阻色谱（size exclusion chromatography）SEC 凝胶过滤色谱 (gel filtration chromatography)GFC 不应有作用力 根据分子大小 离子交换色谱(Ion exchange chromatography)IEC 电荷力 电荷 聚焦色谱 等电点 正相色谱 氢键、定向力（或选择 性作用力） 反相色谱 非选择性作用力 疏 水 色 谱 HIC(hydrophobic interaction chromatography) 疏水相互作用力和非选 择性作用力 疏水性 亲 和 色 谱 Affinity chromatography 选择性的生物作用力 亲和性 各类色谱中溶质与固定相间的相互作用力

2 色谱种类 相互作用力类型 特点 体积排阻色谱（size exclusion chromatography）SEC 凝胶过滤色谱 (gel filtration chromatography)GFC 不应有作用力 根据分子大小 离子交换色谱(Ion exchange chromatography)IEC 电荷力 电荷 聚焦色谱 等电点 正相色谱 氢键、定向力（或选择 性作用力） 反相色谱 非选择性作用力 疏 水 色 谱 HIC(hydrophobic interaction chromatography) 疏水相互作用力和非选 择性作用力 疏水性 亲 和 色 谱 Affinity chromatography 选择性的生物作用力 亲和性 各类色谱中溶质与固定相间的相互作用力

3 ■ 色析法的发展过程： 圆形滤纸 长条滤纸 薄层层析 (TLC) 管柱层析 容量变大 容量更大 加展开液 Adapted from Scope RK (1987) Protein Purification – Principles and Practice p.9 Paper partition chromatography (PPC) Martin, Synge (1952)

3 ■ 色析法的发展过程： 圆形滤纸 长条滤纸 薄层层析 (TLC) 管柱层析 容量变大 容量更大 加展开液 Adapted from Scope RK (1987) Protein Purification – Principles and Practice p.9 Paper partition chromatography (PPC) Martin, Synge (1952)

4 ■ 色层分析法的基本机制： ● 极性相似的两分子间，其亲和力较强。 极性 → 极性 非极性 → 非极性 Like Dissolves Like

4 ■ 色层分析法的基本机制： ● 极性相似的两分子间，其亲和力较强。 极性 → 极性 非极性 → 非极性 Like Dissolves Like

5 L L ■ 色层分析法的基本原理： 流动相 Mobile phase 固定相 Stationary phase 样本分子依其分子极性 选择亲和两相之一 ADSORPTION PARTITION Liquid - Solid Liquid - Liquid 两相系統 A B C 每次分离样本 都要做一次选择 One Plate of Separation (理论板数) S 极 性 L 非 极 性 极 性 非 极 性 样本 样本

5 L L ■ 色层分析法的基本原理： 流动相 Mobile phase 固定相 Stationary phase 样本分子依其分子极性 选择亲和两相之一 ADSORPTION PARTITION Liquid - Solid Liquid - Liquid 两相系統 A B C 每次分离样本 都要做一次选择 One Plate of Separation (理论板数) S 极 性 L 非 极 性 极 性 非 极 性 样本 样本

6 .凝胶过滤色谱 GFC是一种纯粹按照溶质分子在流动相溶 剂中的体积大小分离的色谱法 填料具有一定范围的孔尺寸，大分子进不 去而先流出色谱柱，小分子后流出

6 .凝胶过滤色谱 GFC是一种纯粹按照溶质分子在流动相溶 剂中的体积大小分离的色谱法 填料具有一定范围的孔尺寸，大分子进不 去而先流出色谱柱，小分子后流出

7 ■ 凝胶过滤法是一种 Partition 层析法： 样本 固 定 相 流 动 相 小分子 被阻滞 小分子 大分子 Stokes radius 分子大小、 形状 较快流出

7 ■ 凝胶过滤法是一种 Partition 层析法： 样本 固 定 相 流 动 相 小分子 被阻滞 小分子 大分子 Stokes radius 分子大小、 形状 较快流出

8 ■ 各 种 色 析 胶体 ： Pharmacia Bio-Rad Sephadex Sepharose Sephacryl Sephacel BioGel P BioGel A glucose (dextrose) agarose glucose + acrylamide cellulose acrylamide agarose FPLC Superose, Superdex Mono Q, Mono S

8 ■ 各 种 色 析 胶体 ： Pharmacia Bio-Rad Sephadex Sepharose Sephacryl Sephacel BioGel P BioGel A glucose (dextrose) agarose glucose + acrylamide cellulose acrylamide agarose FPLC Superose, Superdex Mono Q, Mono S

9 传统SEC填料 粗、中、细 Sephadex葡聚糖凝胶—（瑞典 Pharmacia 公 司—Amersham） 肽和球蛋白的分离范围 G10 -700 G15 -1500 G25 1000~5000 G50 1500~30000 G75 3000~80000 G100 4000~150000 超细4000~100000 G150 5000~300000 超细5000~150000 G200 5000~600000 超细5000~250000

9 传统SEC填料 粗、中、细 Sephadex葡聚糖凝胶—（瑞典 Pharmacia 公 司—Amersham） 肽和球蛋白的分离范围 G10 -700 G15 -1500 G25 1000~5000 G50 1500~30000 G75 3000~80000 G100 4000~150000 超细4000~100000 G150 5000~300000 超细5000~150000 G200 5000~600000 超细5000~250000

10 Sephacryl 烯丙烯基葡聚糖与N、N’-亚甲基 双丙烯酰胺经共聚而制备的一种共价交联 的刚性珠体。 S-200 5000~250,000 S300/400/500/1000 Sepharose琼脂糖凝胶2B/4B/6B Sepharose CL交联琼脂糖 琼脂糖与2，3-二 溴丙醇在强碱性条件下反应而得

10 Sephacryl 烯丙烯基葡聚糖与N、N’-亚甲基 双丙烯酰胺经共聚而制备的一种共价交联 的刚性珠体。 S-200 5000~250,000 S300/400/500/1000 Sepharose琼脂糖凝胶2B/4B/6B Sepharose CL交联琼脂糖 琼脂糖与2，3-二 溴丙醇在强碱性条件下反应而得