《临床检验仪器学》课程教学资源（讲义）实验09 荧光分光光度计的使用

实验9荧光分光光度计的使用 实验目的 1.了解荧光分光光度计的基本原理与结构。 2.学会荧光分光光度计的基本操作方法。 实验器材 荧光分光光度计一台，交流稳压电源一台，石英比色皿一个，蒸馏水10ml, 乙醇10ml。 实验原理 荧光分光光度计是通过测定物质分子产生的荧光强度进行物质的定性与 定量分析的实验室常规分析仪器。由光源灯发出的复合光经激发单色器进行 单色处理后，发射单色光射入样品，样品受激发出的荧光经发射单色器进行 单色处理后，到达接收器进行光电转换，然后将光信号转换为电信号进入信 号处理系统处理，再送至信号发出系统 仪器描述 荧光分光光度计的结构包括激发光源、单色器（包括激发单色器和发射 单色器)、样品池、检测器、记录显示系统等基本部分，见图14-1。 图14-1荧光分光光度计结构示意 实验步骤 1.测试蒸馏水的荧光光谱 (1)已知的测试条件 1 EXCITATION WAVELENGTH :350nm ②EMISSION RANGE :350nmM~450nm ③SCAN SPEED :FAST ④ABSCISSA SCALE :×2(2) ⑤ORDINATE SCALE :×647) ⑥SENSITIVLTY :HΠGH(1)

实验 9 荧光分光光度计的使用 实验目的 1．了解荧光分光光度计的基本原理与结构。 2．学会荧光分光光度计的基本操作方法。 实验器材 荧光分光光度计一台，交流稳压电源一台，石英比色皿一个，蒸馏水 10ml， 乙醇 10ml。 实验原理 荧光分光光度计是通过测定物质分子产生的荧光强度进行物质的定性与 定量分析的实验室常规分析仪器。由光源灯发出的复合光经激发单色器进行 单色处理后，发射单色光射入样品，样品受激发出的荧光经发射单色器进行 单色处理后，到达接收器进行光电转换，然后将光信号转换为电信号进入信 号处理系统处理，再送至信号发出系统。 仪器描述 荧光分光光度计的结构包括激发光源、单色器（包括激发单色器和发射 单色器）、样品池、检测器、记录显示系统等基本部分，见图 14-1。 图 14-1 荧光分光光度 计结 构示 意 实验步骤 1．测试蒸馏水的荧光光谱 （1）已知的测试条件 ① EXCITATION WAVELENGTH :350nm ② EMISSION RANGE :350nmM~450nm ③ SCAN SPEED :FAST ④ ABSCISSA SCALE : 2(2) ⑤ ORDINATE SCALE :64(7) ⑥ SENSITIVLTY :HIGH(1)

⑦EX.EM SELECT :EM ⑧KEPEAT :OFF ⑨SLIT :EX10nm(3) :EM10nm(3) (2)上述测试条件可按如下的操作键进行设定。 ①EX GO TO 回团回 ENTER ②EM RANGE B5☐E☐NTER4□☐I ENTER ③SCAN SPEED 2ENTER ④AB- SCISSA SCALE 2 ENTER ⑤ ORDI- NATE ISCALE □ENTER ⑥ SENSI- IVITY 1ENTE® ⑦ 让XEM的EM一侧的指示灯亮。 ⑧让REPEAT的指示灯不亮。 ⑨SLIT]E]ENTER3]ENTER]。 (3)将盛有蒸馏水的样本固定于试样池支架上。 (4)按下键CHART FEED,使记录纸空白转出3cm左右。 (5)按 LIST健。 (6)按 START/STOP键. 通过以上操作，便可测试出蒸馏水的荧光光谱。 2.未知物质样本的荧光光谱测定在测定条件未知的样本测试时，可先 将激发波长设定为250m测定荧光光谱，通过测得的荧光光谱求出荧光波长

SCAN SPEED AB— SCISSA SCALE SENSI— TIVITY ORDI— NATE SCALE EM RANGE EX GO TO ⑦ EX.EM SELECT :EM ⑧ KEPEAT :OFF ⑨ SLIT :EX 10nm(3) :EM 10nm(3) （2）上述测试条件可按如下的操作键进行设定。 ① 3 5 0 ENTER ② 3 5 0 ENTER 4 5 0 ENTER ③ 2 ENTER ④ 2 ENTER ⑤ 7 ENTER ⑥ 1 ENTER ⑦ 让 EX|EM 的 EM 一侧的指示灯亮。 ⑧ 让 REPEAT 的指示灯不亮。 ⑨ SLIT 3 ENTER 3 ENTER 。 （3）将盛有蒸馏水的样本固定于试样池支架上。 （4）按下键 CHART FEED，使记录纸空白转出 3cm 左右。 （5）按 LIST 键。 （6）按 START / STOP 键。 通过以上操作，便可测试出蒸馏水的荧光光谱。 2．未知物质样本的荧光光谱测定 在测定条件未知的样本测试时，可先 将激发波长设定为 250nm 测定荧光光谱，通过测得的荧光光谱求出荧光波长

然后按此荧光波长设定荧光分光器的波长，测定激发光谱，求出激发波长。 用激发波长再次设定激发分光器后，测定荧光光谱。最终决定适当的激发波 长和荧光波长。 (1)将设定后的初始测试条件进行如下的变更： EX GOTO 250ENTER EM RANG 2 SIO]ENTER7IOO□ENTNR ORDI- NATE SCALE 7ENTER (2)将未知试样盛入试样池，然后固定于试样池支架上。 (3)按下HART FEED键，使记录纸空白转出3cm~4cm (4)按 IST键 (5)按START/S TOP☐键 (6)测试得到的光谱中波长250nm和500nm的谱峰是激发光产生的散 射光。 (7)以相同的条件对溶液进行空白测试。 (8)空白溶液所得到的光谱中也同样可观测到溶液的拉曼线及所含杂质 的荧光光谱，从试样的光谱减去空白溶液的光谱，使可得到未知试样的荧光 光谱。 (9)若没有测试出未知试样的光峰，可将激发光波长以50nm为单位向长 波方向移动，进行荧光测试，重复(6)、(7)、(8)的操作。 (I0)将EXEM键，设定为EX(激发分光器)。 (11)按下CHART FEED]健，使记录纸空白转出3cm~4cm (12)按START/STOP☐键 (13)激发光谱上在荧光分光器波长和其1/2波长出现的是散射光的峰。 (14)将溶液透入试样池，进行激发光谱的测试，将以上得到的两个激发 光谱进行比较，减去空白溶液的拉曼线之后得到试样的激发光谱。 (15)所得的激发波长和荧光波长便可用于定量测定。激发、荧光光谱都

EX GOTO EM RANG E 然后按此荧光波长设定荧光分光器的波长，测定激发光谱，求出激发波长。 用激发波长再次设定激发分光器后，测定荧光光谱。最终决定适当的激发波 长和荧光波长。 （1）将设定后的初始测试条件进行如下的变更： 2 5 0 ENTER 2 5 0 ENTER 7 0 0 ENTNR 7 ENTER （2）将未知试样盛入试样池，然后固定于试样池支架上。 （3）按下 CHART FEED 键，使记录纸空白转出 3cm～4cm （4）按 LIST 键 （5）按 START/STOP 键 （6） 测试得到的光谱中波长 250nm 和 500nm 的谱峰是激发光产生的散 射光。 （7）以相同的条件对溶液进行空白测试。 （8）空白溶液所得到的光谱中也同样可观测到溶液的拉曼线及所含杂质 的荧光光谱，从试样的光谱减去空白溶液的光谱，使可得到未知试样的荧光 光谱。 （9）若没有测试出未知试样的光峰，可将激发光波长以 50nm 为单位向长 波方向移动，进行荧光测试，重复（6）、（7）、（8）的操作。 （10）将 EX|EM 键，设定为 EX（激发分光器）。 （11）按下 CHART FEED 键，使记录纸空白转出 3cm～4cm （12）按 START / STOP 键 （13）激发光谱上在荧光分光器波长和其 1/2 波长出现的是散射光的峰。 （14）将溶液透入试样池，进行激发光谱的测试，将以上得到的两个激发 光谱进行比较，减去空白溶液的拉曼线之后得到试样的激发光谱。 （15）所得的激发波长和荧光波长便可用于定量测定。激发、荧光光谱都 ORDI－ NATE SCALE

有两个以上峰时，应选用峰值最大且溶液空白实验中基线噪音较少的峰。 数据记录及处理 1.记录蒸馏水的荧光光谱。 2.记录未知物质样本的荧光光谱。 思考题 1.简述荧光分光光度计的工作原理。 2.荧光分光光度计的结构包括哪些基本部分？ 3.荧光测定中应该注意的主要问题是什么？

有两个以上峰时，应选用峰值最大且溶液空白实验中基线噪音较少的峰。 数据记录及处理 1．记录蒸馏水的荧光光谱。 2．记录未知物质样本的荧光光谱。 思考题 1．简述荧光分光光度计的工作原理。 2．荧光分光光度计的结构包括哪些基本部分？ 3. 荧光测定中应该注意的主要问题是什么?