《生物化学》课程教学课件（PPT讲稿）第十五章 核酸的研究方法

第十五章核酸的研究方法 Single-Stranded DNA to be Sequenced g▣阿A府可回A网闪a闪A Larger G c fragments Add: 5 c G DNA Polymerase I dATP @@ So the A dGTP 的回金 ⑧ sequence a dCTP of the t dTTP @的金 AC template T plus limiting amounts of strand is G fluorescently labelled 道①的金国 c ddATP 的总①的回金 g ddGTP ddCTP 的国a□国 ddTTP X的名回的金金 Smaller D fragments 的的国的①田 D 国自X的白田的田金 性国的A的国的@a 国的x的@的@@ 自a国的的白田的田日Ls

第十五章 核酸的研究方法

核酸分离纯化及含量测定 (一)核酸的分离、提取原则 要得到完整的天然大分子核酸，一般要注意3点： 1.保持低温(0°~4℃) 。 2.防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌。 3.防止核酸酶的作用。 抑制ONase: 可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去 污剂十二烷基硫酸钠（SDS)；或加蛋白变性剂

（一）核酸的分离、提取原则 要得到完整的天然大分子核酸，一般要注意3点: 1．保持低温（0º～4℃）。 2．防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌。 3．防止核酸酶的作用。 一 、核酸分离纯化及含量测定 抑制DNase： 可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去 污剂十二烷基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂

抑制RNase: (1)实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭 菌的用具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethy1 pyrocarbonate,DEPC)处理。 (2)细胞破碎的同时加入强蛋白变性剂如硫 氰酸胍、异硫氰酸胍等。 (3)加核糖核酸酶阻抑蛋白(RNasin)等RNase 的抑制剂

抑制RNase： （1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭 菌的用具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethyl pyrocarbonate,DEPC）处理。 （2）细胞破碎的同时加入强蛋白变性剂如硫 氰酸胍、异硫氰酸胍等。 （3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase 的抑制剂

(二) DNA的提取 1.材料的选择 2.细胞破碎 3.DNA-蛋白质(DNP)的提取 真核细胞DNA与蛋白质结合成核蛋白(DNP) RNA与蛋白质结合成RNP,而且DNP和RNP常常混在 一起。利用DNP和RNP在不同浓度NaCI中溶解度的 不同来分离DNP和RNP

（二）DNA的提取 1．材料的选择 2．细胞破碎 3．DNA-蛋白质（DNP）的提取 真核细胞DNA与蛋白质结合成核蛋白（DNP）， RNA与蛋白质结合成RNP，而且DNP和RNP常常混在 一起。利用DNP和RNP在不同浓度NaCl中溶解度的 不同来分离DNP和RNP

可用1mol/LNaC1:溶液提取DNP,用水稀释至 0.14no1/L,使DNP纤维沉淀，多次重复以纯化。 相对溶解度 0 0.14 Na&℉(mol/9 DNP在NaCl中的溶解度

可用1mol/LNaCl溶液提取DNP,用水稀释至 0.14mol/L,使DNP纤维沉淀，多次重复以纯化。 0.5 1.0 0 1 2 0.14 相 对 溶 解 度 NaCl（mol/L） DNP在NaCl中的溶解度

4.去蛋白质 (1)苯酚抽提法：水饱和苯酚与DNP一起振荡， 冷冻离心，DNA在上层水相，变性蛋白位于中 间界面，部分停留在苯酚相。多次重复除净蛋白。 (2)氯仿-异戊醇法 (3)酚：氯仿：异戊醇法 (4)SDS-蛋白酶法：细胞悬浮液中加2倍体积 sDs1%的缓冲液，并加入蛋白酶K(100ug/ml) 65℃保温4小时，使细胞蛋白质全部降解，再用 苯酚抽提

4．去蛋白质 （1）苯酚抽提法：水饱和苯酚与DNP一起振荡， 冷冻离心，DNA在上层水相，变性蛋白位于中 间界面，部分停留在苯酚相。多次重复除净蛋白。 （2）氯仿-异戊醇法 （3）酚:氯仿:异戊醇法 （4）SDS-蛋白酶法：细胞悬浮液中加2倍体积 SDS 1%的缓冲液，并加入蛋白酶K（100ug/ml） 65℃保温4小时，使细胞蛋白质全部降解，再用 苯酚抽提

5.沉淀DNA:合并水相DNA,在盐存在的条件 下加2倍体积冷的乙醇，DNA沉淀，用乙醚、乙 醇洗涤沉淀。 6.去RNA杂质：可用纯RNasel除去少量RNA。 7.进一步纯化：柱层析；电泳；密度梯度离心等 原核生物的DNA是裸露的，与蛋白质结合不多， 分离纯化要简单些

5．沉淀DNA： 合并水相DNA，在盐存在的条件 下加2倍体积冷的乙醇， DNA沉淀，用乙醚、乙 醇洗涤沉淀。 6．去RNA杂质：可用纯RNase除去少量RNA。 7．进一步纯化：柱层析；电泳；密度梯度离心等。 原核生物的DNA是裸露的，与蛋白质结合不多， 分离纯化要简单些

DNA分离纯化流程 破碎细胞 浓盐溶液◆ 稀释 DNP沉淀 苯酚抽提（或氯仿-辛醇）除蛋 白冷乙醇 DNA沉淀· 乙醚和乙 醇洗沉淀·柱层析；电泳；氯化铯密度梯度 离心；·纯DNA

• 破碎细胞 浓盐溶液 稀释 DNP沉淀 苯酚抽提（或氯仿-辛醇）除蛋 白 冷乙醇 DNA沉淀 乙醚和乙 醇洗沉淀 柱层析；电泳；氯化铯密度梯度 离心 ； 纯DNA DNA分离纯化流程

(三)RNA的提取 1.大分子RNA的提取 (1)异硫氰酸胍/苯酚-氯仿-SDS抽提法 (2)异硫氰酸胍/氯化铯密度梯度离心 蛋白质密度1.89g/cm3。 2.mRNA的提取 具有poly(A)的mRNA,可用oligo(dT) 亲和层析

（三）RNA的提取 1．大分子RNA的提取 （2）异硫氰酸胍/氯化铯密度梯度离心 蛋白质密度 1.89g/cm 3 。 （1）异硫氰酸胍/苯酚-氯仿-SDS抽提法 2．mRNA的提取 具有poly（A）的mRNA，可用oligo（dT） 亲和层析

4.核酸含量的测定 核酸含量测定的方法有： 。紫外分光光度法：测260nm的光密度。 定磷法：磷与钼酸作用生成磷钼酸，被还原 成钼蓝，660nm处有最大吸收峰。 。定糖法： 加热 DNA:酸+二苯胺+脱氧核糖 蓝色（595nm) 加热 RNA: 盐酸+甲基间苯二酚+核糖 鲜绿色(670nm)

核酸含量测定的方法有： ：测260nm的光密度。 ：磷与钼酸作用生成磷钼酸，被还原 成钼蓝，660nm处有最大吸收峰。 ： ：酸 + 二苯胺 + 脱氧核糖 蓝色（595nm） ：盐酸 +甲基间苯二酚 +核糖 鲜绿色（ 670nm） 4.核酸含量的测定 加热 加热