《生物化学》课程教学课件（PPT讲稿）第八章 蛋白质的性质和分离纯化 Properties and Purification of Protein（蛋白质分离纯化及含量测定）

第七章蛋白质的性质和分离纯化 Properties and Purification of Protein Dextran bead 688

第七章 蛋白质的性质和分离纯化 Properties and Purification of Protein

第二节蛋白质分离纯化及含量测定 蛋白质分离纯化的总目标： 。增加制品的纯度或比活性（单位蛋白质 重量中目标蛋白质的含量或生物活性) 蛋白质分离纯化的基本原则： ·选择好的材料 ÷摸清目的蛋白质的稳定性 。探索有效的抽提法和浓缩法 ·建立一套层析的组合 以较好的方法贮存

第二节 蛋白质分离纯化及含量测定 蛋白质分离纯化的总目标: ❖ 增加制品的纯度或比活性（单位蛋白质 重量中目标蛋白质的含量或生物活性） 蛋白质分离纯化的基本原则: ❖ 选择好的材料 ❖ 摸清目的蛋白质的稳定性 ❖ 探索有效的抽提法和浓缩法 ❖ 建立一套层析的组合 ❖ 以较好的方法贮存

蛋白质分离纯化的步骤及具体方法 、 初（粗）提 三、细分级分离 组织、细胞破碎 (精纯化) 缓冲液提取。 ÷分子筛层析 二、粗分级分离 亲和层析 (粗纯化) 。疏水/反相层析 。盐析 。离子交换层析 有机溶剂沉淀 吸附层析 等电点沉淀 。电泳等 超滤浓缩等 四、结晶

一、初(粗)提 ❖ 组织、细胞破碎 ❖ 缓冲液提取。 二、粗分级分离 （粗纯化） ❖ 盐析 ❖ 有机溶剂沉淀 ❖ 等电点沉淀 ❖ 超滤浓缩等 三、细分级分离 （精纯化） ❖ 分子筛层析 ❖ 亲和层析 ❖ 疏水/反相层析 ❖ 离子交换层析 ❖ 吸附层析 ❖ 电泳等 四、结晶 蛋白质分离纯化的步骤及具体方法

蛋白质分离纯化的方法依据性质 。蛋白质分子的大小 。蛋白质溶解度 ·蛋白质电荷状况 。蛋白质吸附性质 ÷蛋白质生物学亲和性

❖ 蛋白质分子的大小 ❖ 蛋白质溶解度 ❖ 蛋白质电荷状况 ❖ 蛋白质吸附性质 ❖ 蛋白质生物学亲和性 蛋白质分离纯化的方法依据性质

依据分子大小不同的纯化方法 加压 1、透析和超滤 透析：分离无机盐、单糖 蛋白质溶液 等小分子。 半透膜 超滤：分离无机盐、单糖 支持膜的栅板 等小分子。 超滤液 超滤

一、依据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超滤 透析：分离无机盐、单糖 等小分子。 超滤：分离无机盐、单糖 等小分子

透析示意图

透析示意图

2、密度梯度离心 蔗糖1.28g/cm3 4% 聚蔗糖(Fico11) 8% 12% 16% 20%

2、密度梯度离心 蔗糖 1.28g/cm3 聚蔗糖（Ficoll） 4% 8% 12% 16% 20%

3、凝胶过滤 也称分子排阻层析、分子筛层析，这是根据蛋白 质分子大小不同来分离纯化蛋白质的一种方法

3、凝胶过滤 也称分子排阻层析、分子筛层析，这是根据蛋白 质分子大小不同来分离纯化蛋白质的一种方法

Protein mixture Buffer Porous polymer Elution bead column Large Small molecules molecules can't enter enter pores bead in bead Collect Medium-size fractions molecules partially Largest Smallest enter bead molecules molecules

依据溶解度差别的纯化方法 1、盐析法 在蛋白质的抽提液中加入一定量的中性盐，使 蛋白质沉淀下来，常用的中性盐为(NH4)2S04、 NH,C1等。 。中性盐对球状蛋白的溶解度有显著的影响： 盐溶：低浓度的中性盐可增加蛋白质的溶解度。 盐析：高浓度的中性盐，如饱和(NH4)S04使 蛋白质溶解度下降，从溶液中沉淀析出

1、盐析法 ❖在蛋白质的抽提液中加入一定量的中性盐，使 蛋白质沉淀下来，常用的中性盐为(NH4)2SO4、 NH4Cl等。 ❖中性盐对球状蛋白的溶解度有显著的影响： 盐溶：低浓度的中性盐可增加蛋白质的溶解度。 盐析：高浓度的中性盐，如饱和(NH4)2SO4使 蛋白质溶解度下降，从溶液中沉淀析出。 二、依据溶解度差别的纯化方法