南京农业大学：《园艺植物育种学》课程教学资源（实验指导）实验三 花粉的贮藏和生活力测定

实验三花粉的贮藏和生活力测定一、目的和要求在正常条件下花粉在雌蕊上萌发的能力，就是花粉的生活力。花粉生活力测定在杂交工作中很重要，尤其亲本花期不相同需要从外地采集花粉作父本时，花粉要经过一段较长时间的贮藏运输过程，因此在杂交前应检验花粉的生活力，以免应用无生活力的花粉而造成杂交工作的失败。从生产上来看，在选择相互授粉的品种时，也应考虑到品种的花粉发芽能力，凡是花粉发育不全的品种，其花粉的发芽率都很低。因此不适宜做授粉品种。本实验的主要目的是掌握花粉贮藏和花粉生活力测定的方法。二、花粉及用具材料：桃或苹果树的花粉。用具：显微镜、天平、盖玻片、凹式载玻片、培养皿、干燥器、试管、滴瓶蒸馏水、凡士林、蔗糖、氯化钙、琼脂、联苯胺、α-奈酚、碳酸钠、过氧化氢等。三、方法（一）花粉贮藏从发育良好的植株上采下将开的花朵、取出花药放在纸上或培养皿中，放于干燥的室内，令其开裂，花药裂开后将花粉倒入小玻璃瓶或指形管中，口上塞以棉花或橡皮塞，贴上写有品种名称的标签。再把花粉瓶放于干燥器内，使花粉在空气相对湿度较低的条件下（一般0～40%）保存：为了减少呼吸作用，可以放在低温（0～4℃）黑暗的地方贮藏。（二）花粉生活力试验1、花粉发芽法人为的创造适合于花粉发芽的环境条件，以花粉发芽的情况来鉴定花粉生活力的强弱，此法的缺点是花粉发芽条件与实际不完全相符，所得的结果与实际有一定的差异，但操作方便，能测定出相对发芽率来。（1）培养基的制作与接种一般采用5～20%蔗糖或葡萄糖加1~2%琼脂，溶于蒸留水中。加热煮沸即可，将已配制好的培养基保持在40℃温度即不凝固，用玻璃棒点一点培养基敷在载玻片的凹坑内，然后用接种针或解剖针沾以少量花粉。轻轻振动，使花粉均匀地撒在培养基上，将载玻片放在垫有湿润棉花培养皿内或倒扣在培养皿上，并

实验三 花粉的贮藏和生活力测定 一、目的和要求 在正常条件下花粉在雌蕊上萌发的能力，就是花粉的生活力。花粉生活力测 定在杂交工作中很重要，尤其亲本花期不相同需要从外地采集花粉作父本时，花 粉要经过一段较长时间的贮藏运输过程，因此在杂交前应检验花粉的生活力，以 免应用无生活力的花粉而造成杂交工作的失败。 从生产上来看，在选择相互授粉的品种时，也应考虑到品种的花粉发芽能力， 凡是花粉发育不全的品种，其花粉的发芽率都很低。因此不适宜做授粉品种。 本实验的主要目的是掌握花粉贮藏和花粉生活力测定的方法。 二、花粉及用具 材料：桃或苹果树的花粉。 用具：显微镜、天平、盖玻片、凹式载玻片、培养皿、干燥器、试管、滴瓶、 蒸馏水、凡士林、蔗糖、氯化钙、琼脂、联苯胺、α-奈酚、碳酸钠、过氧化氢 等。 三、方法 （一）花粉贮藏 从发育良好的植株上采下将开的花朵、取出花药放在纸上或培养皿中，放于 干燥的室内，令其开裂，花药裂开后将花粉倒入小玻璃瓶或指形管中，口上塞以 棉花或橡皮塞，贴上写有品种名称的标签。再把花粉瓶放于干燥器内，使花粉在 空气相对湿度较低的条件下（一般 0～40%）保存；为了减少呼吸作用，可以放 在低温（0～4℃）黑暗的地方贮藏。 （二）花粉生活力试验 1、花粉发芽法 人为的创造适合于花粉发芽的环境条件，以花粉发芽的情况来鉴定花粉生活 力的强弱，此法的缺点是花粉发芽条件与实际不完全相符，所得的结果与实际有 一定的差异，但操作方便，能测定出相对发芽率来。 （1）培养基的制作与接种 一般采用 5～20%蔗糖或葡萄糖加 1～2%琼脂，溶于蒸馏水中。加热煮沸即 可，将已配制好的培养基保持在 40℃温度即不凝固，用玻璃棒点一点培养基敷 在载玻片的凹坑内，然后用接种针或解剖针沾以少量花粉。轻轻振动，使花粉均 匀地撒在培养基上，将载玻片放在垫有湿润棉花培养皿内或倒扣在培养皿上，并

贴上标签写明处理、种类、播种日期，将培养血放于20℃的恒温箱中培养。（2）观察记数在显微镜下隔一定时间检查一次（花粉发芽快的经过几个小时即可观察到已经发芽，慢的需24小时以上）若发现花粉已发芽时，便按一定方向，就同一视野中用记数器记录花粉粒总数和发芽数，观察记录3～5个显微镜视野的数字，求其平均数，即得出花粉发芽百分率。花粉发芽的标准，以花粉管伸长超出花粉直径为准。2.染色法（1）过氧化物酶测定法原理：具有生活力的花粉含有活跃的过氧化物酶。此酶能利用过氧化物使各种多酚及芳香族胺发生氧化而产生颜色，依据颜色可知花粉有无活力。过氧化物酶*H2O+[O]H202OHH2N+ 2 [0]NH2HH11NNOS+2H20对二萘氧基联苯胺（紫红色）a.0.2克联苯胺溶于100毫升50%的酒精溶液；b.0.15克a-萘酚溶于100毫升50%酒精溶液；c.0.25克的碳酸钠溶解在100毫升的蒸馏水中。以上三种溶液分别放入棕色瓶中备用，使用时将这三种溶液等量配成试剂I，放入棕色滴瓶中备用，在使用前准备好0.3%的过氧化氢水溶液作为试剂Ⅱ。使用时，先在载玻片上加少量待测花粉，然后在花粉上滴试剂I和试剂ⅡI各一滴，仔细搅匀，盖上盖玻片，经3～4分钟后，再放在显微镜下检查，有生活力的花粉呈红色或玫瑰色，无生活力的花粉为黄色或无色，为了确定具有生活力的花粉百分率，要连续观察3～5个视野，求其平均值，将观察结果填入表内。（2）碘-碘化钾染色法原理：正常的花粉积累淀粉较多，而不正常的花粉则少。据此，可用化学物1

1 贴上标签写明处理、种类、播种日期，将培养皿放于 20℃的恒温箱中培养。 （2）观察记数 在显微镜下隔一定时间检查一次（花粉发芽快的经过几个小时即可观察到已 经发芽，慢的需 24 小时以上）若发现花粉已发芽时，便按一定方向，就同一视 野中用记数器记录花粉粒总数和发芽数，观察记录 3～5 个显微镜视野的数字， 求其平均数，即得出花粉发芽百分率。花粉发芽的标准，以花粉管伸长超出花粉 直径为准。 2．染色法 （1）过氧化物酶测定法 原理：具有生活力的花粉含有活跃的过氧化物酶。此酶能利用过氧化物使各 种多酚及芳香族胺发生氧化而产生颜色，依据颜色可知花粉有无活力。 对二萘氧基联苯胺（紫红色） a．0.2 克联苯胺溶于 100 毫升 50%的酒精溶液； b．0.15 克 a-萘酚溶于 100 毫升 50%酒精溶液； c．0.25 克的碳酸钠溶解在 100 毫升的蒸馏水中。 以上三种溶液分别放入棕色瓶中备用，使用时将这三种溶液等量配成试剂 Ⅰ，放入棕色滴瓶中备用，在使用前准备好 0.3%的过氧化氢水溶液作为试剂Ⅱ。 使用时，先在载玻片上加少量待测花粉，然后在花粉上滴试剂Ⅰ和试剂Ⅱ各 一滴，仔细搅匀，盖上盖玻片，经 3～4 分钟后，再放在显微镜下检查，有生活 力的花粉呈红色或玫瑰色，无生活力的花粉为黄色或无色，为了确定具有生活力 的花粉百分率，要连续观察 3～5 个视野，求其平均值，将观察结果填入表内。 （2）碘-碘化钾染色法 原理：正常的花粉积累淀粉较多，而不正常的花粉则少。据此，可用化学物 H2O2 H2O + [O] H2N NH2 + 2 O H N H N +2H2O 过氧化物酶 OH + 2 [O] O

质染色，根据皇色反应来间接测定花粉的止常与否和花粉生活力的差别。通常止常花粉用I-KI染色后呈蓝色，而发育不良畸形花粉则不积累淀粉，当I-KI染色时呈黄褐色。步骤和方法：取花粉撒于载玻片上，加一滴蒸馏水，用镊子使花粉散开，再加一滴I-KI溶液，盖上盖玻片置于显微镜下观察，凡被染色呈蓝色表示具有生活力，呈黄褐色者为发育不良生活力弱的花粉。（3）氯化三苯基四氮唑（TTC）法原理：凡具有生活力的花粉，在其呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而无生活力的花粉则无此反应，因此当TTC渗入有生活力的花粉时，花粉中的脱氢酶在催化去氢过程中与TTC结合，使无色的TTC变成三苯基甲（TTF）而呈红色。试剂配制：I.磷酸盐缓冲液在100ml的蒸馏水中，溶解0.832克Na2HPO4·2H20O和0.273克KH2PO4，调整pH值为7.17。I.TTC溶液称取0.02～0.05克TTC,溶解在10ml的磷酸盐缓冲液中,放入橡色滴瓶内，置于暗处。TTC为有毒物质，操作时应注意安全。步骤和方法：取少量花粉放在载玻片上，在花粉上滴1～2滴TTC溶液，用镊子使其混匀后，盖上盖玻片。将此载玻片上置于恒温箱中（3540℃）约15～20分钟，在显微镜（100倍）下观察。凡有生活力的花粉粒呈红色，其次呈淡红色，失去生活力的和不育的花粉粒表现无色。四、作业1.绘出花粉发芽前后形态图。2.统计几种测定方法花粉发芽率。3.将发芽法与染色法测定的结果作一比较，分析其差异原因。2

2 质染色，根据呈色反应来间接测定花粉的正常与否和花粉生活力的差别。通常正 常花粉用 I-KI 染色后呈蓝色，而发育不良畸形花粉则不积累淀粉，当 I-KI 染色 时呈黄褐色。 步骤和方法：取花粉撒于载玻片上，加一滴蒸馏水，用镊子使花粉散开，再 加一滴 I-KI 溶液，盖上盖玻片置于显微镜下观察，凡被染色呈蓝色表示具有生 活力，呈黄褐色者为发育不良生活力弱的花粉。 （3）氯化三苯基四氮唑（TTC）法 原理：凡具有生活力的花粉，在其呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而无 生活力的花粉则无此反应，因此当 TTC 渗入有生活力的花粉时，花粉中的脱氢 酶在催化去氢过程中与 TTC 结合，使无色的 TTC 变成三苯基甲（TTF）而呈红 色。 试剂配制： I．磷酸盐缓冲液 在 100ml 的蒸馏水中，溶解 0.832 克 Na2HPO4·2H2O 和 0.273 克 KH2PO4，调整 pH 值为 7.17。 Ⅱ．TTC 溶液 称取 0.02～0.05 克 TTC,溶解在 10ml 的磷酸盐缓冲液中,放 入橡色滴瓶内,置于暗处。TTC 为有毒物质,操作时应注意安全。 步骤和方法：取少量花粉放在载玻片上，在花粉上滴 1～2 滴 TTC 溶液，用 镊子使其混匀后，盖上盖玻片。将此载玻片上置于恒温箱中（35～40℃）约 15～ 20 分钟，在显微镜（100 倍）下观察。凡有生活力的花粉粒呈红色，其次呈淡红 色，失去生活力的和不育的花粉粒表现无色。 四、作业 1．绘出花粉发芽前后形态图。 2．统计几种测定方法花粉发芽率。 3．将发芽法与染色法测定的结果作一比较，分析其差异原因

表2-1花粉生活力观察记载表花粉发芽率（或染色后具有生活力的花粉百分率）种发芽前花发芽后花处理时间类粉形态粉形态重复I重复IⅡI重复IⅢI总计发发发发t未发花*花未发发花*芽芽芽芽粉发发芽粉芽粉发芽粉发茅检查插种率率率率数芽数数数数茅芽数芽数数%%%%3

3 表 2-1 花 粉 生 活 力 观 察 记 载 表 种 类 处理 时间 发芽前花 粉形态 发芽后花 粉形态 花粉发芽率（或染色后具有生活力的花粉百分率） 重复 I 重复Ⅱ 重复Ⅲ 总 计 播种 检查 花 粉 数 未 发 芽 发 芽 数 发 芽 率 % 花 粉 数 未 发 芽 发 芽 数 发 芽 率 % 花 粉 数 未 发 芽 发 芽 数 发 芽 率 % 花 粉 数 未 发 芽 发 芽 数 发 芽 率 %

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