《农业微生物学》课程授课教案（实验讲义）1、环境中微生物的检测 2、细菌的革兰氏染色 3、油镜的使用 4、细菌的芽孢染色

农业微生物学实验一操作流程 【实验内容】1、环境中微生物的检测 2、细菌的革兰氏染色 3、油镜的使用 4、细菌的芽孢染色 【实验前的准备及核对】 1、请将自带的一切物品如书包、文具、衣物、水杯等放到柜子内或边台上。 2、核对实验材料： (1)牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基(5套/4人) (2)S.a呢s和E.coh斜面（各1支/2人），孔雀绿染色的枯草芽孢杆菌悬液一支(I支/2人) (3)接种环、镊子、肾形盘、环形架、显微镜(1套/人) (4)记号笔(1支2人) 【1、环境中微生物的检测】 1.1准备 每人领取1个己倒好的牛肉音蛋白胨琼脂培养皿平板，在培养皿底部边缘用记号笔写上姓名、 组别及日期等（字尽量小）。 1.2处理 与其他同学商量后，选择下列4种方法中的一种进行处理，并做好标记是何种处理： A打开培养皿盖，在空气中暴露20分钟，然后盖上皿盖。（标记为“空气”） B.打开培养皿盖，在培养皿的上方抖动自己的衣服数下，然后盖上皿盖。（标记为“衣”） C.打开培养皿盖，用未洗过的手指触摸平板左半边，暂时盖上盖子：将手用肥皂仔细清洗后， 再打开培养皿盖，用手指触摸右半边，然后盖上皿盖。（标记为“洗过手”或“未洗手”） D.打开培养皿盖，取下一根自己的头发放到培养基上，用灭过菌的接种环压紧，然后盖上皿盖。 (标记为“发”) 1.3培养及观察 将处理好的培养皿翻转（底部朝上），放入培养皿箱内，送28℃恒温箱中培养2~3天，观察牛肉音蛋白胨琼 脂表面有无南落长出，并注意观察不同微生物菌落之间的差别

1 【实验内容】1、环境中微生物的检测 2、细菌的革兰氏染色 3、油镜的使用 4、细菌的芽孢染色 【实验前的准备及核对】 1、请将自带的一切物品如书包、文具、衣物、水杯等放到柜子内或边台上。 2、核对实验材料： （1）牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基（5 套/ 4 人） （2）S. aureus 和 E. coli 斜面（各 1 支/ 2 人），孔雀绿染色的枯草芽孢杆菌悬液一支(1 支/ 2 人） （3）接种环、镊子、肾形盘、环形架、显微镜（1 套/ 人） （4）记号笔（1 支/2 人） 【1、环境中微生物的检测】 1.1 准备 每人领取 1 个已倒好的牛肉膏蛋白胨琼脂培养皿平板，在培养皿底部边缘用记号笔写上姓名、 组别及日期等（字尽量小）。 1.2 处理 与其他同学商量后，选择下列 4 种方法中的一种进行处理，并做好标记是何种处理： A. 打开培养皿盖，在空气中暴露 20 分钟，然后盖上皿盖。（标记为“空气”） B. 打开培养皿盖，在培养皿的上方抖动自己的衣服数下，然后盖上皿盖。（标记为“衣”） C. 打开培养皿盖，用未洗过的手指触摸平板左半边，暂时盖上盖子；将手用肥皂仔细清洗后， 再打开培养皿盖，用手指触摸右半边，然后盖上皿盖。（标记为“洗过手”或“未洗手”） D. 打开培养皿盖，取下一根自己的头发放到培养基上，用灭过菌的接种环压紧，然后盖上皿盖。 （标记为“发”） 1.3 培养及观察 将处理好的培养皿翻转（底部朝上），放入培养皿箱内，送 28℃恒温箱中培养 2~3 天，观察牛肉膏蛋白胨琼 脂表面有无菌落长出，并注意观察不同微生物菌落之间的差别。 农业微生物学实验一操作流程

农业微生物学实验一操作流程 【2、细菌的革兰氏染色】 2.1取载玻片从玻片缸内用慑子夹出一块载玻片，滗去多余的酒精，在酒精灯上将烧一下载玻片，烧去残 留的酒精。将载玻片放到环形架上。 2.2涂片在载玻片的左、右各加一小滴蒸馏水，按无菌操作法取少许的Ec(量一定不能太多)，在左边 的蒸馏水中涂布成直径为0.5cm的菌赛：同样方法取少许的S.awreus在右边的蒸馏水中涂布。 2.3晾干让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 2.4固定手执载玻片一端，让南膜朝上，通过火焰23次固定（以不烫手为宜）。 2.5结晶紫染色将玻片置于肾形盘的环形架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟 2.6水洗倾去染色液，用水小心地冲洗残留的染液。 2.7碘液媒染滴加适量卢哥氏碘液，染色1min。 2.8水洗用水洗去碘液 2.995%乙醇脱色将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20一25s至流出液无色，立即水洗。 2.10蕃红复染滴加蕃红复染1min。 2.11水洗用水洗去涂片上的蕃红染色液。 2.12晾干将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 准备用油镜进行观察。 【3、油镜的使用】 3.1从柜子内将显微镜拿出，拿出时要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。取下 镜套，接通电源，打开电源开关。 3.2依次用低倍镜，高倍镜对标本进行观察。 3.3油镜的使用按下列步骤操作： (1)先用粗调节旋钮将载物台下降约2cm,并将高倍镜转出。 (2)在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 (3)从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。 (4)从接目镜内观察，放大光圈，上调豪光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降，当出现 物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已高开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重 复上述操作。 3.4观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许二甲苯，擦去镜头 上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2一3下即可（注意向一个方向擦拭）。 2

农业微生物学实验一操作流程 2 【2、细菌的革兰氏染色】 2.1 取载玻片 从玻片缸内用镊子夹出一块载玻片，滗去多余的酒精，在酒精灯上将烧一下载玻片，烧去残 留的酒精。将载玻片放到环形架上。 2.2 涂片 在载玻片的左、右各加一小滴蒸馏水，按无菌操作法取少许的 E. coli（量一定不能太多），在左边 的蒸馏水中涂布成直径为 0.5cm 的菌斑；同样方法取少许的 S. aureus 在右边的蒸馏水中涂布。 2.3 晾干 让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 2.4 固定 手执载玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰 2-3 次固定（以不烫手为宜）。 2.5 结晶紫染色 将玻片置于肾形盘的环形架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色 1 分钟。 2.6 水洗 倾去染色液，用水小心地冲洗残留的染液。 2.7 碘液媒染 滴加适量卢哥氏碘液，染色 1min。 2.8 水洗 用水洗去碘液。 2.9 95%乙醇脱色 将玻片倾斜，连续滴加 95%乙醇脱色 20—25s 至流出液无色，立即水洗。 2.10 蕃红复染 滴加蕃红复染 1min。 2.11 水洗 用水洗去涂片上的蕃红染色液。 2.12 晾干 将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 准备用油镜进行观察。 【3、油镜的使用】 3.1 从柜子内将显微镜拿出，拿出时要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。取下 镜套，接通电源，打开电源开关。 3.2 依次用低倍镜，高倍镜对标本进行观察。 3.3 油镜的使用按下列步骤操作： （1）先用粗调节旋钮将载物台下降约 2cm，并将高倍镜转出。 （2）在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 （3）从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。 （4）从接目镜内观察，放大光圈，上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降，当出现 物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重 复上述操作。 3.4 观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许二甲苯，擦去镜头 上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭 2—3 下即可（注意向一个方向擦拭）

农业微生物学实验一操作流程 3.5将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将镜筒下降至最 低，降下聚光器，将镜套套好后，将显微镜放回柜内。 【4、芽孢的染色】 4.1老师已做好的步骤： (1)制备菌液：加5m无菌水于长有枯草芽孢杆菌的斜面上（己培养48h以上），用接种环将菌体刮下，打匀， 制成浓稠的菌液。 (2)加染色液：加5%孔雀绿水溶液2一3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合 (3)加热：将此试管浸于沸水浴（烧杯），加热15一20min。 4.2以下由同学们完成： (4)涂片：用接种环从试管底部挑数环茵液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干。 (5)固定：将涂片通过酒精灯火焰3次。 (6)脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。 (7)复染：加蓄红水溶液染色5min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。 (8)镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜观察， 结果：芽孢呈绿色，芽孢囊和菌体为红色。 【实验结束后的整理】 1、正确记录实验结果，并请指导老师检查实验结果 2、在规定时间内来观察环境中微生物的检测的实验结果。 3、收拾自己实验台，将使用过的各样物品归位，保持实验前的原样。 4、请指导老师检查显微镜的使用情况并签字、检查所用物品的数量及完好情况。 6、指导老师同意后方可离开。 7、值日生清扫地面，擦拭桌面。 8、课后预习下一次实验，下次上实验时交上实验报告

农业微生物学实验一操作流程 3 3.5 将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将镜筒下降至最 低，降下聚光器，将镜套套好后，将显微镜放回柜内。 【4、芽孢的染色】 4.1 老师已做好的步骤： （1）制备菌液：加 5ml 无菌水于长有枯草芽孢杆菌的斜面上（已培养 48h 以上），用接种环将菌体刮下，打匀， 制成浓稠的菌液。 （2）加染色液：加 5%孔雀绿水溶液 2—3 滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。 （3）加热：将此试管浸于沸水浴（烧杯），加热 15～20min。 4.2 以下由同学们完成： （4）涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干。 （5）固定：将涂片通过酒精灯火焰 3 次。 （6）脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。 （7）复染：加蕃红水溶液染色 5min 后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。 （8）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜观察。 结果：芽孢呈绿色，芽孢囊和菌体为红色。 【实验结束后的整理】 1、正确记录实验结果，并请指导老师检查实验结果。 2、在规定时间内来观察环境中微生物的检测的实验结果。 3、收拾自己实验台，将使用过的各样物品归位，保持实验前的原样。 4、请指导老师检查显微镜的使用情况并签字、检查所用物品的数量及完好情况。 6、指导老师同意后方可离开。 7、值日生清扫地面，擦拭桌面。 8、课后预习下一次实验，下次上实验时交上实验报告