《药物分析》课程授课教案（讲稿）第四章 药物的含量测定方法与验证（2/2）

讲禾稿课程名称：药物分析课程编号：y230508授课学期：第六学期授课班级：10级药学任课教师：一张志斐河北联合大学药学院1

1 讲 稿 课程名称： 药物分析 课程编号： y230508 授课学期： 第六学期 授课班级： 10 级药学 任课教师： 张志斐 河北联合大学 药学院

首页课程名称：《药物分析》第_6周,第_11_讲次摘要第四章药物的含量测定方法与验证授课题目（章、节）第二节样品分析的前处理方法第三节药品质量标准分析方法验证【目的要求】通过本讲课程，学习样品分析的前处理方法和药品质量标准分析方法验证【重点】样品分析的前处理方法和药品质量标准分析方法验证【难点】样品分析的前处理方法内容【本讲课程的引入】样品分析前都需要怎样的前处理？药品质量标准分析方法验证的项目和内容都有哪些？板书“前处理方法和方法验证”。【本讲课程的内容】第二节、样品分析的前处理方法一、不经有机破坏的方法1.水解法：适用于：结合不牢固的含金属或含卤素有机药物（1）酸水解法：水难溶性含金属有机药物与矿酸（盐酸）共热（2）碱水解法：含卤素有机药物（脂肪碳链）与氢氧化钠溶液回流有机结合的待测元素原子离解，转化为无机盐（离子）2.还原法：适用于：结合牢固的含碘有机药物（直接与芳环连接）碱性溶液中加锌粉回流，使碳-碘键还原转化为无机碘化物二、经有机破坏的方法适用于：含金属、卤素、氮、硫、磷等有机药物（待测原子与碳原子结合牢固者）1.湿法破坏：适用于含氮有机药物分析的前处理硫酸作为分解剂，氧化剂（硝酸，高氯酸）辅助分解剂注意：①空白校正②通风橱内（1）硝酸-高氯酸法：适用手血、尿、组织等生物样品的破环，有机金属药物经破坏后，得到的无机金属离子一般呈高价态不能用于含氮杂环药物的破坏（2）硝酸-硫酸法：适用于大多数有机物质的破坏，破坏得到的无机金属离子均为高价态不能用于含碱土金属有机药物的破坏（3）硫酸-硫酸盐法：往样品中加入浓硫酸作氧化剂，加入硫酸盐提高硫酸的沸点，增强硫酸的氧化破坏能力，且防止硫酸的分解损失2

2 首页 课程名称：《药物分析》 第 6 周，第 11 讲次 摘 要 授课题目（章、节） 第四章 药物的含量测定方法与验证 第二节 样品分析的前处理方法 第三节 药品质量标准分析方法验证 【目的要求】通过本讲课程,学习样品分析的前处理方法和药品质量标准分析方法验证 【重 点】样品分析的前处理方法和药品质量标准分析方法验证 【难 点】样品分析的前处理方法 内 容 【本讲课程的引入】样品分析前都需要怎样的前处理？药品质量标准分析方法验证的项 目和内容都有哪些？ 板书“前处理方法和方法验证”。 【本讲课程的内容】 第二节、样品分析的前处理方法 一、不经有机破坏的方法 1. 水解法： 适用于: 结合不牢固的含金属或含卤素有机药物 （1）酸水解法：水难溶性含金属有机药物与矿酸(盐酸)共热 （2）碱水解法：含卤素有机药物(脂肪碳链)与氢氧化钠溶液回流 有机结合的待 测元素原子离解, 转化为无机盐(离子) 2. 还原法： 适用于: 结合牢固的含碘有机药物(直接与芳环连接) 碱性溶液中加锌粉回流, 使碳-碘键还原转化为无机碘化物 二、经有机破坏的方法 适用于: 含金属、卤素、氮、硫、磷等有机药物(待测原子与碳原子结合牢固者) 1.湿法破坏：适用于含氮有机药物分析的前处理 硫酸作为分解剂, 氧化剂(硝酸,高氯酸)辅助分解剂 注意：①空白校正 ② 通风橱内 （1）硝酸-高氯酸法：适用于血、尿、组织等生物样品的破坏，有机金属药物经破 坏后，得到的无机金属离子一般呈高价态 不能用于含氮杂环药物的破坏 （2）硝酸-硫酸法：适用于大多数有机物质的破坏，破坏得到的无机金属离子均为 高价态 不能用于含碱土金属有机药物的破坏 （3）硫酸-硫酸盐法：往样品中加入浓硫酸作氧化剂，加入硫酸盐提高硫酸的沸点， 增强硫酸的氧化破坏能力，且防止硫酸的分解损失

常用于含砷或有机药物的破坏，破坏得到的无机金属离子多为低价态（4）凯氏定氮法：1）消解剂与助剂：硫酸一硫酸钾-硫酸铜硫酸：消解剂：硫酸钾：提高沸点：硫酸铜：催化剂：硼酸：固氮（NH·HBO）2）供试品：常量法含氮25~30mg；半微量法：1.0~2.0mg3）应用范围：含有氨基或酰氨（胺）结构（5）其它湿法1）硝酸一硫酸一高氯酸法2）硫酸一氧化剂法（过氧化氢法、高锰酸钾法）破坏后，金属呈高价态2.干法破坏：适用于湿法不易破坏完全的有机物以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等）有机药物的破坏环（1）高温炽灼法：含卤素药物的鉴别、含磷药物含量测定无水碳酸钠，硝酸镁，氢氧化钙，氧化锌等辅助灰化(2）氧瓶燃烧法：1)将有机药物放入充满氧气的密闭的燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据预测物质的性质，采用适宜的方法进行分析①有机结构：彻底分解为CO2和H20②待测元素：转化为不同价态的氧化物（或无氧酸），被吸收于适当的吸收液中（多以酸根离子形式存在）2)适合于含X、S、N、Se等元素的有机药物3）特点：简便、快速、破坏完全，尤其适用于微量样品的分析4)仪器装置：①燃烧瓶：无色、磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶（石英玻璃）500、1000或2000ml：10-20mg:500ml200mg:1000-2000ml②铂丝：瓶塞空心，底部熔封铂丝一根，下端呈螺旋状或网状1mm:2/35）称样用材料：①固体样品：无灰滤纸②液体样品：纸袋③软膏类样品：将适量样品置不含被测成分的蜡油纸中包裹严密，外层再用无灰滤纸包裹6）氧气7）吸收液：①作用：吸收液的作用是将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态②燃烧产物与吸收液氟：HF吸收液：水氯：HC1吸收液：水-氢氧化钠溴：Br2+HBr吸收液：水-氢氧化钠-二氧化硫碘：I2(+HIO)吸收液：水-氢氧化钠（二氧化硫）3

3 常用于含砷或锑有机药物的破坏，破坏得到的无机金属离子多为低价态 （4）凯氏定氮法： 1）消解剂与助剂: 硫酸-硫酸钾-硫酸铜 硫酸：消解剂; 硫酸钾：提高沸点;硫酸铜：催化剂; 硼酸：固氮(NH3·H3BO3) 2）供试品: 常量法含氮 25~30mg; 半微量法: 1.0~2.0mg 3）应用范围: 含有氨基或酰氨(胺)结构 （5）其它湿法 1) 硝酸—硫酸—高氯酸法 2) 硫酸—氧化剂法（过氧化氢法、高锰酸钾法） 破坏后，金属呈高价态 2.干法破坏： 适用于湿法不易破坏完全的有机物以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物 不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等）有机药物的破坏 （1）高温炽灼法： 含卤素药物的鉴别、含磷药物含量测定 无水碳酸钠,硝酸镁,氢氧化钙,氧化锌等辅助灰化 (2) 氧瓶燃烧法: 1)将有机药物放入充满氧气的密闭的燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的 欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据预测物质的性质，采用适宜的方法进行分析 ① 有机结构: 彻底分解为 CO2和 H2O ② 待测元素: 转化为不同价态的氧化物(或无氧酸),被吸收于适当的 吸收液中(多以酸根离子形式存在) 2)适合于含 X、S、N、Se 等元素的有机药物 3)特点：简便、快速、破坏完全，尤其适用于微量样品的分析 4)仪器装置: ①燃烧瓶:无色、磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶(石英玻璃) 500、1000 或 2000ml : 10-20mg:500ml 200mg:1000-2000ml ②铂丝: 瓶塞空心，底部熔封铂丝一根，下端呈螺旋状或网状 1mm; 2/3 5）称样用材料： ①固体样品：无灰滤纸 ②液体样品：纸袋 ③ 软膏类样品：将适量样品置不含被测成分的蜡油纸中包裹严密，外 层再用无灰滤纸包裹 6）氧气 7）吸收液： ①作用：吸收液的作用是将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、 硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态 ② 燃烧产物与吸收液 氟：HF 吸收液：水 氯：HCl 吸收液：水-氢氧化钠 溴：Br2+HBr 吸收液：水-氢氧化钠-二氧化硫 碘：I2(+HIO) 吸收液：水-氢氧化钠(二氧化硫)

吸收液：水-过氧化氢硫：S0（+SO)磷：P20s-HaP207，(HP03)n:吸收液：水-硝酸（煮沸）8）注意事项：①根据被燃烧分解的样品量选用适宜大小的燃烧瓶正确选用燃烧瓶的目的：样品能在足够的氧气中燃烧分解完全；有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸收液中：防止爆炸的可能性②测定含氟有机药物时，用石英制燃烧瓶③铂丝燃烧时起催化作用④应同时做空白试验③燃烧时要注意防爆③燃烧要完全燃烧产生的烟雾完全被吸收第三节、药品质量标准分析方法验证一、需验证的项目：1.鉴别试验2.杂质检查3.含量测定4.防腐剂5.溶出度，释放度二、验证的内容1.准确度（accuracy）（1）定义：指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度（2）一般用回收率（%）表示：回收率%=（测定平均值一空白值）/加入量×100%（3）数据要求：9个测定结果3个不同浓度（80，100，120%），每个浓度各3份报告已知加入量的回收率，或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。（4）化学药：1）原料药：用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确度的另一方法测定的结果进行比较。2）制剂：要考察辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中加入原料对照品的方法作回收率试验，计算RSD。（5）中药：加样回收试验1）回收率%=（C-A）/BA为供试品所含被测组分的量：（已准确测定药物含量A的真实样品）B为加入对照品的量；C为实测值2）取同一浓度供试品，6个测定结果进行评价或同化学药应报告供试品取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果、回收率（%）和RSD%3）一般要求：RSD<2%UV和HPLC：回收率可达98%~102%：容量法：回收率可达99.7%~100.3%4

4 硫：SO3(+SO2) 吸收液：水-过氧化氢 磷：P2O5→H4P2O7,(HPO3)n: 吸收液：水-硝酸(煮沸) 8）注意事项： ① 根据被燃烧分解的样品量选用适宜大小的燃烧瓶 正确选用燃烧瓶的目的：样品能在足够的氧气中燃烧分解完全； 有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸收液中； 防止爆炸的可能性 ② 测定含氟有机药物时，用石英制燃烧瓶 ③ 铂丝燃烧时起催化作用 ④ 应同时做空白试验 ⑤ 燃烧时要注意防爆 ⑥ 燃烧要完全 ⑦ 燃烧产生的烟雾完全被吸收 第三节、药品质量标准分析方法验证 一、需验证的项目： 1.鉴别试验 2.杂质检查 3.含量测定 4.防腐剂 5.溶出度,释放度 二、验证的内容 1.准确度（ accuracy） （1）定义：指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度 （2）一般用回收率(%)表示：回收率%=（测定平均值—空白值）/加入量×100% （3）数据要求：9 个测定结果 3 个不同浓度(80,100,120％)，每个浓度各 3 份 报告已知加入量的回收率，或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。 （4）化学药： 1）原料药：用已知纯度对照品或样品进行测定； 或与已建准确度的另一方法测定的结果进行比较。 2）制剂：要考察辅料对回收率的影响。 采用在空白辅料中加入原料对照品的方法作回收率试验，计算 RSD。 （5）中药：加样回收试验 1） 回收率% =（C-A)/B A 为供试品所含被测组分的量；(已准确测定药物含量 A 的真实样品) B 为加入对照品的量； C 为实测值 2）取同一浓度供试品，6 个测定结果进行评价或同化学药 应报告供试品取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果、 回收率（%）和 RSD% 3）一般要求： RSD＜2% UV 和 HPLC：回收率可达 98%～102%； 容量法：回收率可达 99.7%～100.3%

2.精密度（precision）（1）定义：同一均匀供试品多次取样测定所得结果之间的接近程度（2）用标准偏差（s，SD)或相对标准偏差（RSD)表示（3）数据要求同“准确度”（4）分类：1）重复性：批内精密度或日内精密度同一分析人员连续测定所得结果的精密度2）中间精密度：批间精密度或日间精密度不同时间不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度3）重现性：在不同实验室不同人员测定结果之间的精密度用法定标准采用的分析方法进行3.专属性（specificity）（1）定义：在其他成分（杂质，降解产物，辅料等）可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性（2）应用：鉴别，杂质检查和含量测定方法1）鉴别反应：空白，结构相似物或有关物质呈负反应2）含量与杂质测定：含杂质或降解产物的试样中各峰能获得分离4.检测限（limitofdetection，LoD）（1）定义：试样中被测物能被检测出的最低浓度或量（2）是一种限度检验效能指标，反映方法灵敏度(3）方法：1）自视法：适用于可用目视法直接评价结果的分析方法，非仪器分析法例：鉴别的显色法；杂质检查的TLC2）信噪比法：适用于能直观显示信号与基线噪声水平的分析方法，如HPLC信噪比S/N=3(2)时的相应浓度或量3）标准偏差法：适用于不能直观比较信噪比的仪器分析方法，如UV-Vis法LOD = -35s -#x3Ss5.定量限：(limitofquantitation，LoQ）An（1）定义：指试样中被测物能被定量测定的最低量（2）反映方法的灵敏度（3）测定结果应具有一定准确度和精密度（4）杂质和降解产物用定量方法研究时、应确定LOC（5）LOQ的测定方法与LOD相同相应的系数（倍数）不同，如信噪比S/N=106.线性（linearity）（1）定义：指在设计的“范围”内，响应值（y）与被测物浓度（x）直接呈正比关系的程度y=ax+b（2）系列（n≥5）供试样品测定，以响应信号作为被测物浓度的函数作图（3）用最小二乘法进行线性回归：或经数学转换后再进行线性回归7.范围（range）（1）定义：指方法适用的高低限浓度或量的区间在试验研究开始前确定验证的范围和方法在范围内应能达到一定精密度，准确度和线性（2）涉及定量测定的项目均需对范围进行验证如：含量测定、含量均匀度、溶出度或释放度、特殊元素或特殊杂质的定量检查原料药/制剂含量测定：80%~120%5

5 2. 精密度 （ precision ) （1）定义 ：同一均匀供试品多次取样测定所得结果之间的接近程度 （2）用标准偏差(s,SD)或相对标准偏差(RSD)表示 （3）数据要求同“准确度” （4）分类： 1）重复性：批内精密度或日内精密度 同一分析人员连续测定所得结果的精密度; 2）中间精密度：批间精密度或日间精密度 不同时间不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度 3）重现性：在不同实验室不同人员测定结果之间的精密度 用法定标准采用的分析方法进行 3.专属性( specificity ) （1）定义：在其他成分(杂质,降解产物,辅料等)可能存在下,方法能正确测定出被 测物的特性 （2）应用：鉴别,杂质检查和含量测定方法 1）鉴别反应：空白, 结构相似物或有关物质呈负反应 2）含量与杂质测定：含杂质或降解产物的试样中各峰能获得分离 4.检测限( limit of detection, LOD ） （1）定义：试样中被测物能被检测出的最低浓度或量 （2）是一种限度检验效能指标,反映方法灵敏度 (3) 方法： 1）目视法：适用于可用目视法直接评价结果的分析方法, 非仪器分析法 例：鉴别的显色法;杂质检查的 TLC 2）信噪比法：适用于能直观显示信号与基线噪声水平的分析方法, 如 HPLC 信噪比 S/N=3(2)时的相应浓度或量 3）标准偏差法：适用于不能直观比较信噪比的仪器分析方法, 如 UV-Vis 法 5.定量限：(limit of quantitation, LOQ ) （1）定义：指试样中被测物能被定量测定的最低量 （2）反映方法的灵敏度 （3）测定结果应具有一定准确度和精密度 （4）杂质和降解产物用定量方法研究时, 应确定 LOQ （5）LOQ 的测定方法与 LOD 相同相应的系数(倍数)不同, 如信噪比 S/N=10 6.线性（ linearity ） （1）定义：指在设计的“范围”内, 响应值(y)与被测物浓度(x)直接呈正比关系 的程度 y = ax + b （2）系列(n≥5)供试样品测定,以响应信号作为被测物浓度的函数作图 （3）用最小二乘法进行线性回归; 或经数学转换后再进行线性回归 7.范围（ range ） （1）定义：指方法适用的高低限浓度或量的区间在试验研究开始前确定验证的范 围和方法在范围内应能达到一定精密度,准确度和线性 （2）涉及定量测定的项目均需对范围进行验证 如: 含量测定、含量均匀度、溶出度或释放度、特殊元素或特殊杂质的定量检查 原料药/制剂含量测定: 80%~120% 空 样 样 空 S A C LOD = f 3S =  3

制剂含量均匀度检查：70%~130%溶出度或释放度检查：下限-20%~上限+20%下限-20%~上限+20%特殊元素含量测定：杂质测定：限度±20%若杂质检查与含量测定同时进行，杂质限度-20%~含量上限+20%8.耐用性（ruggedness）（1）定义：指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度：体现测定条件的允许变动范围（2）HPLC法典型因素有：流动相的组成和pH值及流速，不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱，柱温等GC法典型因素有：不同厂牌或批号的色谱柱，固定相，不同类型的担体，柱温，进样口和检测器温度等三、验证内容的选择一般原则：1.非定量分析方法：鉴别，杂质的限度检查法验证“专属性”，“检测限”和“耐用性”2.定量分析方法：原料药或制剂的含量测定及含量均匀度，溶出度或释放度的测定方法除“检测限”和“定量限”外，其余均验证3.微量定量分析方法：杂质的定量测定方法除“检测限”视情况而定外，其余均验证【本讲课程的小结】今天我们主要讲了样品分析的前处理方法和药品质量标准分析方法验证。希望同学们重点学习前处理方法和分析方法验证内容。【本讲课程的作业】1.测定药物片剂的溶出度或释放度时，对所用测定方法应要求（）C.耐用性D.回收率A.精密度B.定量限E.检测限2.A.精密度B.定量限C.两者皆是D.两者皆不是1）某法测得一组测量值间彼此符合程度（）2）测量值和真值接近的程度（）3）测定结果的重现性（）4）可定量测得被测药物的最低水平参数（）5）药物分析方法的效能指标（）)3.药物杂质检查所要求的效能指标为（A.准确度B.精密度C.专属性D.检测限E.耐用性：4.应要求的效能指标：D.两者均不要求A检测限B.定量限C.两者均要求)1）含量测定方法评估（2)杂质限量检查（3)杂质定量测定（4)溶出度测定（)5)中间体含量测定（6

6 制剂含量均匀度检查: 70%~130% 溶出度或释放度检查: 下限-20%~上限+20% 特殊元素含量测定: 下限-20%~上限+20% 杂质测定： 限度±20% 若杂质检查与含量测定同时进行, 杂质限度-20％~含量上限+20% 8.耐用性（ ruggedness ） （1）定义：指在测定条件有小的变动时, 测定结果不受影响的承受程度; 体现 测定条件的允许变动范围 （2）HPLC 法典型因素有: 流动相的组成和 pH 值及流速, 不同厂牌或不同批号 的同类型色谱柱, 柱温等 GC 法典型因素有: 不同厂牌或批号的色谱柱, 固定相, 不同类型的担体, 柱温, 进样口和检测器温度等 三、验证内容的选择 一般原则: 1.非定量分析方法：鉴别,杂质的限度检查法 验证“专属性”,“检测限”和“耐用性” 2.定量分析方法：原料药或制剂的含量测定及含量均匀度,溶出度或释放度的测定方法 除“检测限”和“定量限”外, 其余均验证 3.微量定量分析方法：杂质的定量测定方法 除“检测限”视情况而定外, 其余均验证 【本讲课程的小结】今天我们主要讲了样品分析的前处理方法和药品质量标 准分析方法验证。希望同学们重点学习前处理方法和分析方法验证内容。 【本讲课程的作业】 1.测定药物片剂的溶出度或释放度时，对所用测定方法应要求( ) A.精密度 B.定量限 C.耐用性 D.回收率 E.检测限 2. A．精密度 B．定量限 C．两者皆是 D．两者皆不是 1） 某法测得一组测量值间彼此符合程度（ ） 2）测量值和真值接近的程度（ ） 3）测定结果的重现性（ ） 4）可定量测得被测药物的最低水平参数（ ） 5）药物分析方法的效能指标（ ） 3.药物杂质检查所要求的效能指标为（ ） A.准确度 B.精密度 C.专属性 D.检测限 E.耐用性 4.应要求的效能指标： A. 检测限 B. 定量限 C. 两者均要求 D. 两者均不要求 1)含量测定方法评估（ ） 2)杂质限量检查（ ） 3)杂质定量测定（ ） 4)溶出度测定（ ） 5)中间体含量测定（ ）