厦门大学：《现代生物实验学》课程教学课件（PPT讲稿）实验七 DNA的纯化与鉴定

实验七 DNA的纯化与鉴定

实验七 DNA的纯化与鉴定

一．实验目的及背景  在生物技术实验中，我们粗提取的ＤＮＡ需分离纯化 去处蛋白质等杂质，我们都需要将最终的结果在琼脂 糖凝胶， 或ＰＡＧＥ凝胶上走电泳观察，以判断我们 实验的正确性以及DNA片段的完整性。同时通过紫外 分光光度计测定OD260,OD280的吸收值，以确定DNA 的浓度和纯度。  核酸经凝胶电泳后，在ＥＢ（溴化乙锭）中浸染，核 酸分子与溴化乙锭结合后， 能吸收300-360mm波长的 紫外光，同时诱发出液长为５９０nm的红橙色荧光， 从而可通过照像机摄影，凝胶成像系统记录实验结果。 DNA浓度的计算根据郎伯-比尔定理（E=abc）计算。 根据经验1OD260=0.05ug/ul DNA。DNA纯度的判断根 据OD260/OD280的比值判断，符合要求纯度高的纯化 DNA其OD260/OD280在1.6-1.8之间，低于此范围表明 蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA

一．实验目的及背景  在生物技术实验中，我们粗提取的ＤＮＡ需分离纯化 去处蛋白质等杂质，我们都需要将最终的结果在琼脂 糖凝胶， 或ＰＡＧＥ凝胶上走电泳观察，以判断我们 实验的正确性以及DNA片段的完整性。同时通过紫外 分光光度计测定OD260,OD280的吸收值，以确定DNA 的浓度和纯度。  核酸经凝胶电泳后，在ＥＢ（溴化乙锭）中浸染，核 酸分子与溴化乙锭结合后， 能吸收300-360mm波长的 紫外光，同时诱发出液长为５９０nm的红橙色荧光， 从而可通过照像机摄影，凝胶成像系统记录实验结果。 DNA浓度的计算根据郎伯-比尔定理（E=abc）计算。 根据经验1OD260=0.05ug/ul DNA。DNA纯度的判断根 据OD260/OD280的比值判断，符合要求纯度高的纯化 DNA其OD260/OD280在1.6-1.8之间，低于此范围表明 蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA

二. 实验试剂及器材  酚：氯仿：异戊醇（25：２４：１）  ７０％乙醇 ＴＥ buffer  RNase  琼脂糖  TBE电泳缓冲液  电泳设备  紫外分光光度计  凝胶成像系统

二. 实验试剂及器材  酚：氯仿：异戊醇（25：２４：１）  ７０％乙醇 ＴＥ buffer  RNase  琼脂糖  TBE电泳缓冲液  电泳设备  紫外分光光度计  凝胶成像系统

三．实验方法  1. 加入RNase至终浓度１０μg/ul ３７℃反应１ 小时。  2. 加入酚：氯仿：异戊醇（２５：２４：１） 等体积各抽提2-3次，取上清。  3. 加入１/10倍体积３M NaAc(pH5.2)，２倍体 积无水乙醇混匀，－２０℃下10min-30min。  4. 15000rpm，离心10分钟。  5. ＤＮＡ沉淀用 ７０％乙醇洗２次， ３７℃ 烘干ＤＮＡ（无乙醇）。  6. １００μl TE buffer溶解沉淀

三．实验方法  1. 加入RNase至终浓度１０μg/ul ３７℃反应１ 小时。  2. 加入酚：氯仿：异戊醇（２５：２４：１） 等体积各抽提2-3次，取上清。  3. 加入１/10倍体积３M NaAc(pH5.2)，２倍体 积无水乙醇混匀，－２０℃下10min-30min。  4. 15000rpm，离心10分钟。  5. ＤＮＡ沉淀用 ７０％乙醇洗２次， ３７℃ 烘干ＤＮＡ（无乙醇）。  6. １００μl TE buffer溶解沉淀

 7 取20ul DNA母液稀释至1000μl，在紫 外分光光度计上测OD260,OD280。  8. 取10 ul DNA, 在 0.8％琼脂糖凝胶120 伏，1-2小时电泳，  9. 在凝胶成像系统上记录和分析结果

 7 取20ul DNA母液稀释至1000μl，在紫 外分光光度计上测OD260,OD280。  8. 取10 ul DNA, 在 0.8％琼脂糖凝胶120 伏，1-2小时电泳，  9. 在凝胶成像系统上记录和分析结果

四．结果与分析  1．计算ＤＮＡ的得率和纯度  2．记录电泳结果，并估算所提ＤＮＡ的 分子量

四．结果与分析  1．计算ＤＮＡ的得率和纯度  2．记录电泳结果，并估算所提ＤＮＡ的 分子量

四．结果分析  1. 为了获得较为完整的基因组ＤＮＡ在 实验中应注意什么问题？

四．结果分析  1. 为了获得较为完整的基因组ＤＮＡ在 实验中应注意什么问题？