厦门大学：《现代生物实验学》课程教学课件（PPT讲稿）实验十二 DNA连接与转化.ppt_大学文库

实验十二 DNA的连接与转化 1.ＤＮＡ分子的体外连接 2．ＤＮＡ的转化及转化子的筛选

一．实验目的及背景 ▪ 当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆（或表达，转化）质粒载体，并确定重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段之间的体外连接，从而获得重组子。 ▪ 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研究中

1、ＤＮＡ分子的体外连接 ▪ ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程，ＤＮＡ分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的

连接反应中值得注意的几个问题： ▪ 1.ＤＮＡ连接酶 ▪ 常用的ＤＮＡ连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的ＤＮＡ连接酶 (2)来自噬菌体的Ｔ４ＤＮＡ连接酶。 ▪ 二者的作用机理类似

Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机制 ▪ Ｔ４连接酶作用分三步： ▪ １．Ｔ４ＤＮＡ连接酶与辅助因子ＡＴＰ形成酶－ＡＭＰ复合物。 ▪ ２．酶－ＡＭＰ复合物结合到具有５’－磷酸基和３’－羟基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮＡ腺苷化。 ▪ ３．产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来

2.连接反应的温度 ▪ ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃， ▪ 但在此温度下，粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是１２℃过夜

3. DNA的平未端和粘性末端 ▪ 由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。二者连接效率不同。 ▪ 粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的

4.碱性磷酸酶处理质粒载体 ▪ 为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮＡ自生连接问题，为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化，通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。见下图

5.连接反应的检测 ▪ 连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌，阳性克隆的筛选来确定。 ▪ 我们下面的实验从粘性末端为例操作

▪ 二、实验试剂 ▪ １．纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 ▪ ２．１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer ▪ 200mM Tris-HCl(pH7.6) ▪ 50mM MgCl2 ▪ 50mM 二硫苄糖醇 ▪ 500μl/ml BSA ▪ ３．Ｔ４ＤＮＡ连接酶 ▪ ４．5mM ATP